桑白皮基原物种的DNA条形码鉴定研究

沈烈行，李群，岳峰梅，张蕊，高洪录

（1. 山东第一医科大学附属省立医院，山东 济南 250021； 2. 山东省中医药研究院，山东 济南 250014； 3. 东营同安胸外科医院，山东 东营 257000）

DNA 条形码技术（DNA barcoding）是近些年发展起来的分子鉴定的新型技术［1］，它是一段能代表生物遗传特性的，相对较小的，容易扩增的DNA 片段。近年间，我国应用DNA 条形码技术对藓类、芍药属、乌头属等不同种属展开科研并效果显著。目前，对植物科属的鉴定研究多采用ITS2 序列，并利用GenBank 中的样本进行了大量的试验验证，结果表明ITS2 序列不仅可以用在植物的鉴定研究上，在动物上也是可行的。DNA 条形码技术应用于多个领域、多个行业，针对不同的研究对象和内容，尤其在保护生物学、监管动植物产品的非法交易、保护食品安全方面表现突出，提供了有效的鉴定方法。

桑白皮为临床常用中药，历代本草多有记载，最早收载于《神农本草经》，列中品，原名“桑根白皮”，其余主流本草基本沿用“桑白皮”名称。2020 年版《中华人民共和国药典》规定，桑白皮来源于桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥根皮。味甘寒，归肺、脾经，具有泻肺平喘、行水消肿之功效，主治肺热喘咳、水肿胀满尿少、面目肌肤水肿等症，是中医临床常用的止咳平喘药，用药历史悠久。

山东是我国重要的桑蚕养殖的基地，尤其是在胶东一带更是如此，据统计，在烟台桑园里保存的种质资源有300 余份。中药桑白皮是桑蚕养殖业的副产品，其获得途径主要是废弃的、生长年限比较长的老桑树的根皮。在桑蚕养殖业中，桑树的新品种是以地上部分，即叶、果等进行区分，而且往往是在桑树老桩上通过嫁接手段实现的。因此，作为养殖业的桑树新品种，其作为药用的树根的根皮（桑白皮）究竟来源于什么品种，是否符合《中华人民共和国药典》的药用标准，有待于结合现代研究手段进行深入研究。

DNA条形码技术在鉴定植物种属方面效果显著［2-12］在其未出现之前对桑白皮的鉴别研究主要是基原、性状、显微、理化这四大传统鉴定方法［13-16］。熊永兴等［17］用DNA 条形码技术对桑白皮及其混伪品进行了鉴定研究，有效区分了桑白皮及其混伪品。

本研究采用ITS2 片段对采集自山东烟台桑园的、有代表性的桑树栽培品种的根皮即桑白皮样品进行基原鉴定，以确定样本的基原物种，为进一步的深入研究和桑树的综合应用打下基础。

1 实验材料及方法

1.1 实验药品

本研究所用桑白皮样品分别采集自山东牟平栽培场（简称牟平）及省桑蚕研究所桑园内（简称桑园），为桑园培育或栽培的桑树优良及推广品种，详见表1。所有样品采集后立刻放入冰箱冷藏备用。

表1 桑白皮样品采集信息表

1.2 试剂和仪器

离心机（5810R/5415D，德国Eppendorf公司）；冰箱（BCD－178CN，中国新飞）；上部卸料离心机（SSC 型，中国捷达）；PCR 仪（96 普通型，中国领宇科技）；测序仪（3730，美国ABI 公司）；电子天平（BSM120.4，上海卓精电子科技有限公司）；球磨仪（MM400，德国莱驰）；电泳仪（JY1000C，北京君意）；水浴锅（HH－4Y，中国啟前）。

Plant Genomic DNA Kit 植物基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型，天根生化科技北京有限公司，批号：DP305）；Platinum®Taq DNA Polymerase［Thermo Fisher、10 × PCR Buffer，Mg2+（50 mmol/L）］；10 μM dNTP Solution（Thermo Fisher）；CTAB提取液（2% CTAB，100 mmol/L pH8.0 Tris－HCl，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA）；液氮；TE缓冲液（10 mmol/L Tris－Hcl，1 mmol/L EDTA pH值8）。

β－巯基乙醇（今品化学技术上海有限公司），氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇（天津市富宇精细化工有限公司），均为分析纯。

1.3 提取DNA

取各样品新鲜根皮组织约30 mg，加入液氮充分研磨。使用植物基因组DNA 试剂盒按照说明书提取DNA。

1.4 聚合酶链式反应（PCR）扩增和测序

采用琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR 产物，PCR 产物经纯化后再进行双向测序。

聚合酶链式反应（PCR）扩增物由上海生工生物有限公司（合成）。ITS2F：5'－ATGC GATA CTTG GTGT GAAT－3' ；ITS3R：5' －GACG CTTC TCCA GACT ACAAT－3'。PCR 反应体系中各组分、 PCR 反应条件分别见表2和表3。

表2 PCR体系中各组分的体积

表3 PCR反应条件

1.5 数据分析

序列拼接时应用CodonCode Aligner 2.06（CondonCode Co，USA）软件进行序列拼接及校对。首先进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，对于ITS2 序列，根据Hidden Markov Model（HMM）模型，去除序列两端5.8 s和28 s 基因区，获得完整的ITS2 基因间隔区序列［18］。然后根据GenBank 数据库进行BLAST 鉴定以及进行DNA条形码鉴定系统鉴定。

2 结果

2.1 DNA定量结果

检测结果显示10个样本DNA含量合格，符合测序要求，结果见表4和图1。

图1 DNA条带结果

表4 DNA定量检测结果

2.2 对PCR产物进行电泳检测结果

电泳检测DNA完整性及DNA残留情况结果显示，10个样本的DNA完整性较好，可以进行PCR扩增和测序。见图2。

图2 PCR产物电泳结果

2.3 测序结果

样品PCR 扩增测序后，去除序列两端5.8 s 和28 s基因区，获得基因间隔区序列，几个基因的间隔区序列完全一致。

2.4 BLAST鉴定结果

2.4.1 DNA条形码鉴定系统鉴定

经DNA条形码鉴定系统鉴定，结果显示10个样本与表内物种序列相似度100%，可鉴定为桑属。结果见表5。

表5 序列对比信息表

2.4.2 GenBank数据库BLAST鉴定

结合 GenBank 数据库BLAST 鉴定结果，所采集的桑白皮样品皆为桑属（Morus）。见图3。

图3 BLAST鉴定图

3 讨论

桑白皮原植物桑树资源十分丰富，目前市场药材来源桑种包含《中华人民共和国药典》规定的桑（Morus albaL.）等在内的多种来源，既有野生，也有家种。由于采收时须毁树挖根，因此古代桑白皮主要来源于野生桑树的可能性较大。历史上桑类中药的原植物确为多种桑树，桑类中药的不少药材来源于养蚕业的剩余物，因而桑类中药的原植物来源于某一种桑树的可能性很小。当今中国桑树资源源于不同桑种的桑树栽培品种上千余个，仅山东烟台保存的种质资源就超过300 份，而各地推广的品种多是为桑蚕业改良，亦因追求产叶量而经常改变。同时，由于桑树易于自然杂交，人工杂交的品种亦层出不穷，虽然历版《中华人民共和国药典》中，桑类中药的原植物Morus albaL.，但是一方面寻找纯粹的Morus albaL. 已非易事，另一方面，如果将非Morus albaL. 的桑树排除在桑类中药原植物之外的话，也无助于改变长期以来养蚕后桑树资源严重浪费的现状，不利于资源的有效利用。

中药桑白皮具有明确的药用疗效和使用价值，在临床上应用也十分广泛。本次实验对山东产或栽培的不同批次的792、湖桑、农桑、鸡冠鲁桑等进行基原鉴别研究，通过DNA 条形码技术对ITS2基因间隔区序列进行一一比对，结果发现所有目标样品都为桑属，为进一步研究和不同品种桑树的综合应用打下基础。

本文再次证明ITS2 序列鉴定相比传统鉴别方法更优，效果更明显，是一种有效、精确的鉴定方法。但是此技术并不是十全十美，依旧存在着诸多缺陷和挑战，更不能完全代替传统鉴定方法。不同的药材具有不同的入药部位，若由于环境、操作、贮存等诸多因素导致DNA 降解过多，必然会影响鉴定的准确性。倘若在实际操作中需要鉴定某一中药材，除用此技术外，还需辅以其他方法进行药材的综合鉴定，以确保鉴定结果的科学性和准确性。