基于VIP－cAMP－PKA－AQP3信号通路探讨益气润肠方治疗气虚型便秘大鼠的作用机制

熊润秋，高月，陈鲁

（1. 山东中医药大学，山东 济南 250014； 2. 山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014）

功能性便秘（functional constipation，FC）是指排便次数减少或粪便干硬难以排出，是儿童期最常见的消化系统疾病之一，国外一项系统性回顾研究显示， 全球儿童FC 平均患病率为9.5%［1］。便秘发病原因不甚明朗，且持续时间长，影响患儿生活质量［2］。现代医学治疗功能性便秘的药物主要是以渗透性泻药、刺激性泻药、肠道促分泌剂、5－HT4受体激动剂、胆汁酸转运抑制剂以及肠道微生态治疗为主［3］，现有适合儿童的药物较少且治疗大多以解决症状为目的，易反复、产生依赖性，故中药治疗便秘具有巨大的研究价值。小儿脏腑娇嫩，形气未充，饮食不能自节，加之肺常不足、脾常不足，故气虚便秘为其临床常见证型，益气润肠方为借助中医传承辅助平台并结合小儿生理、病理特点以及临床经验筛选而成［4］，在临床运用中取得显著疗效。本文通过对气虚型便秘大鼠一般情况及其对结肠组织血管活性肠肽（VIP）/环磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）/水通道蛋白3（AQP3）通路的影响，进一步探讨益气润肠方的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

4 周龄SPF 级SD 雄性大鼠48 只，许可证号：SCXK（鲁）20190003，济南朋悦实验动物繁育有限公司，体质量（180 ± 10）g，实验单位使用许可证编号：SYXK（鲁）20170022。实验动物饲养于山东省中医院动物实验中心屏障环境中，适应性饲养1周，自由饮水采食。

1.2 药物

益气润肠方组方：黄芪24 g，白术24 g，火麻仁6 g，陈皮6 g，肉苁蓉12 g，生地黄12 g，麦冬12 g，玄参12 g，当归12 g和甘草3 g；所有饮片均来自于山东中医药大学附属医院。洛哌丁胺胶囊（西安杨森制药有限公司，国药准字H10910085）；乳果糖口服溶液（北京韩美药品有限公司，国药准字H20065730）。益气润肠方按原方比例混合后加入没过药面约一指节的蒸馏水，大火烧开后转小火熬15 min，收集药液，再次加入蒸馏水大火烧开后转小火熬煮20 min，两次药液混合后浓缩；洛哌丁胺灌胃前予生理盐水配置混悬液，乳果糖灌胃前予生理盐水稀释。

1.3 主要仪器与试剂

KZ－Ⅲ－F 低温型研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；凝胶成像系统（美国Protein Simple 公司）；电泳仪（BIO－RAD）；RIPA裂解液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；PMSF（武汉赛维尔生物科技有限公司）；BCA 蛋白定量检测试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）；10% SDS－PAGE 凝胶制备试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）；5 × 蛋白上样缓冲液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；蛋白预染Marker（Vazyme）；HRP 标记的山羊抗兔二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司）；Anti－Aquaporin 3 Rabbit pAb（武汉赛维尔生物科技有限公司）；Anti－VIP Rabbit pAb（武汉赛维尔生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 动物模型制备

将SD大鼠随机分为空白组8只及模型组40只，空白组每日予生理盐水灌胃，模型组每日予洛哌丁胺混悬液3 mg/（kg·d）灌胃并同时采用饥饱饮食法［5］，每隔5 d称重调整用药剂量，连续2周，建立气虚便秘大鼠模型。2周后将8只空白组大鼠以及随机选取的模型组8只大鼠称重，放入独立代谢笼中24 h，收集粪便，称取粪便重量，结果显示空白组粪便重量及粒数分别为（18.44 ±5.68）g及（62.89 ± 13.23）粒，模型组粪便重量及粪便粒数分别为（9.40 ± 9.88）g及（36.40 ± 10.77）粒，两组比较差异有统计学意义（P< 0.01），表示造模成功。

2.2 分组及给药方法

8 只空白组大鼠每日继续予生理盐水灌胃，40 只造模成功大鼠随机分为模型组、乳果糖组和益气润肠方高、中、低剂量组，每组8只，模型组大鼠每日予生理盐水灌胃，乳果糖组每日给予乳果糖1.67 g/（kg·d）灌胃，益气润肠方低、中、高剂量组每日给予益气润肠方4.375、8.75、17.5 g/（kg·d）灌胃，持续2 周。灌胃结束后，益气润肠方中剂量组及高剂量组各因灌胃不当致死亡脱落1只大鼠。

2.3 检测指标与方法

2.3.1 大鼠体质量、粪便粒数、粪便湿重及粪便含水率的测定

灌胃1 周及2 周测量大鼠体质量，给药结束后，将每组大鼠随机选取5 只放入独立代谢笼中，收集24 h粪便，称取粪便湿重，常温晾干后称取粪便干重，计算粪便含水率。

粪便含水率（%） = ［（粪便湿重 - 粪便干重）/粪便湿重］ × 100%

2.3.2 HE染色法观察结肠病理变化

禁食不禁水12 h 后麻醉大鼠，取约0.5 cm 结肠组织立即放入4%多聚甲醛中固定，后进行酒精梯度脱水、浸蜡、包埋、切片，苏木精、伊红进行染色，梯度脱水、脱蜡后中性树胶封固，显微镜下观察结肠病理变化情况。

2.3.3 qPCR 检测结肠组织VIP、cAMP、PKA、AQP3 mRNA的表达

使用TRIzol 试剂提取结肠组织总RNA，Nanodrop 2 000 检测RNA 浓度及纯度，稀释使其终浓度为200 ng/μL，将RNA 逆转录为cDNA，再根据PCR 试剂盒说明书制备反应体系及引物于PCR 仪上完成扩增，反应条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s；60 ℃延伸30 s；60 ℃退火30 s；40 个循环，绘制溶解曲线，根据各组的 Ct 值，通过内参数值和目的基因数值，计算 ΔCt和 ΔΔCt，得出 2-ΔΔCt，以GAPDH 为内参。引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列

2.3.4 蛋白免疫印迹分析法（Western blot）检测大鼠结肠组织VIP、AQP3蛋白表达量

大鼠麻醉后取结肠组织，立即放入液氮中后转入-80 ℃冰箱中冷冻保存。每组取50 mg 组织用裂解液裂解，离心后取上清液，BCA 法进行蛋白定量后，12% SDS－PAGE 分离，湿转法将蛋白转移到激活后的PVDF 膜上，脱脂奶粉封闭，洗膜后一抗孵育过夜，充分洗涤后加入二抗，室温孵育1 h，最后加入ECL 发光试剂使用全自动化学发光成像分析系统扫描拍照并用ImageJ进行灰度值分析，结果重复3个批次。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况及粪便

益气润肠方可显著增加便秘大鼠粪便重量及粪便粒数，改善便秘大鼠身体状况，增加便秘大鼠体质量，但粪便含水率无统计学意义（P> 0.05）。与空白组比较，模型组大鼠体质量明显降低（P< 0.01），粪便湿重及粒数明显减少（P< 0.01），粪便含水量无统计学意义（P> 0.05）；与模型组比较，益气润肠方低、中、高剂量组和乳果糖组体质量明显增高（P< 0.01，P<0.05），粪便湿重增加、粪便粒数增多（P< 0.05，P<0.01）， 但粪便含水率无统计学意义（P> 0.05）。与乳果糖组比较，益气润肠方中、高剂量组粪便湿重明显增加、粪便粒数显著增多（P< 0.05）。见表2。

表2 各组大鼠体质量、粪便湿重、粪便粒数及粪便含水率的比较（ ± s）

表2 各组大鼠体质量、粪便湿重、粪便粒数及粪便含水率的比较（ ± s）

注：与空白组比较，△P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，*P < 0.01；与乳果糖组比较，▲P < 0.05。

组别空白组模型组乳果糖组益气润肠方低剂量组益气润肠方中剂量组益气润肠方高剂量组n5 5 5 5 5 5造模1周后体质量/g 275.13 ± 11.81 224.88 ± 7.83△229.88 ± 9，20#232.88 ± 6.73#235.63 ± 11.92#233.75 ± 12.08#造模2周后体质量/g 330.88 ± 13.63 288.13 ± 21.05△298.13 ± 14.60#315.75 ± 12.01*313.57 ± 9.50#318.00 ± 12.77*粪便湿重/g 13.60 ± 4.16 5.40 ± 3.29△8.60 ± 4.93#9.80 ± 3.12#15.40 ± 2.61*▲15.00 ± 3.87*▲粪便粒数/粒34.20 ± 18.02 14.60 ± 6.43△18.20 ± 8.04#27.00 ± 12.81#33.80 ± 13.07*▲35.60 ± 19.87*▲粪便含水率/%66.67 ± 11.18 52.94 ± 13.56 58.14 ± 8.53 63.27 ± 6.72 62.34 ± 7.36 58.67 ± 4.91

3.2 各组大鼠结肠HE染色观察

HE 染色可见，空白组黏膜层上皮细胞完整，并且排列整齐、规则，杯状细胞数目多并且形态正常；模型组黏膜层上皮细胞破损、缺失，形态紊乱，杯状细胞减少，腺体形态异常，有大量炎性细胞浸润；乳果糖组结肠腺形态正常，杯状细胞较多，但固有层有大量炎细胞浸润；中药低剂量组偶见黏膜层上皮细胞破损、缺失，杯状细胞数目较模型组增多且形态正常，腺体结构偶见异常；益气润肠方中剂量组及高剂量组黏膜层上皮细胞结构较完整且排列整齐、规则，杯状细胞数目多且形态正常，腺体结构正常，未见炎细胞浸润。见图1。可见益气润肠方可以改善洛哌丁胺造成便秘大鼠的肠道病理形态损害。

图1 各组大鼠肠道病理损害HE染色图（× 200）

3.3 各组大鼠结肠组织VIP、cAMP、PKA、AQP3 mRNA表达的比较

与空白组比较，模型组VIP、cAMP、PKA、AQP3 mRNA 表达明显降低（P< 0.01，P< 0.05）；与模型组比较，乳果糖组及益气润肠方各剂量组VIP、cAMP、PKA、AQP3mRNA 表达升高（P< 0.05，P< 0.01），其中益气润肠方高剂量组最为显著（P< 0.01）。见表3。

表3 各组大鼠结肠组织VIP、cAMP、PKA、AQP3 mRNA表达的比较（ ± s）

表3 各组大鼠结肠组织VIP、cAMP、PKA、AQP3 mRNA表达的比较（ ± s）

注：与空白组比较，△P < 0.01，△△P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05，*P < 0.01；与乳果糖组比较，▲P < 0.05。

组别空白组模型组乳果糖组益气润肠方低剂量组益气润肠方中剂量组益气润肠方高剂量组n3 3 3 3 3 3 VIP 1.00 ± 0.10 0.08 ± 0.01△△0.55 ± 0.25#0.13 ± 0.09#0.10 ± 0.43 1.99 ± 0.36*▲cAMP 1.00 ± 0.15 0.02 ± 0.01△△0.05 ± 0.00#0.64 ± 0.30*0.83 ± 0.40*4.19 ± 1.34*▲PKA 1.00 ± 0.14 0.75 ± 0.08△0.90 ± 0.08#0.76 ± 0.02 1.90 ± 0.10#2.19 ± 0.33*▲AQP3 1.00 ± 0.22 0.15 ± 0.05△△0.39 ± 0.10#0.34 ± 0.07#0.28 ± 0.04 2.14 ± 0.17*▲

3.4 各组大鼠结肠组织VIP、AQP3蛋白表达的比较

蛋白免疫印迹分析发现，相较于空白组，模型组结肠组织中的VIP、AQP3 的蛋白表达量明显降低（P<0.01），经乳果糖及益气润肠方各剂量组治疗后，VIP及AQP3的表达水平明显升高（P< 0.05），益气润肠方低、中剂量的益气润肠方提升VIP 表达水平略逊于乳果糖，高剂量的益气润肠方能显著提高VIP 的蛋白表达水平；相较于乳果糖组，益气润肠方提高AQP3 蛋白表达的能力更强，且呈剂量依赖性，益气润肠方高剂量组能显著提升AQP3的蛋白表达。见图2。

图2 各组大鼠VIP、AQP3蛋白表达情况比较

4 讨论

小儿脏腑娇嫩，形气未充，饮食不能自节，加之肺常不足、脾常不足，故气虚便秘为其常见证型，小儿肾常虚，故治疗便秘时常加入补肾益精之品。益气润肠方来源于黄芪汤加味，在黄芪汤基础上加用补气健脾之白术，补肾益精通便之肉苁蓉二药，意在加强补气健脾之功，同时佐以补肾填精滋阴。方中黄芪为补气健脾第一要药，白术为生，可益气健脾，专补脾阴不足，为治便秘之良药，《伤寒论》中已有白术治疗便秘之记载，现代药理研究也发现白术中的苍术酮可使平滑肌收缩，促进胃肠运动来治疗便秘［6］，此二药等量而用，同为君药，共奏补气健脾、润肠通便之用。陈皮归肺、脾经，助白术、黄芪补气健脾之功，同时陈皮入肺经，肺与大肠相表里，有助通腑之力。当归除归肝、心经外亦归于脾经，陈士铎对其治疗便秘有极高的评价，称“大便燥结，非君之以当归，则硬粪不能下”［7］。有研究表明当归可影响水通道蛋白4（AQP4）的表达水平治疗便秘［8］。火麻仁归脾、胃及大肠经，可润肠通便，有药理研究表明火麻仁的主要成分火麻仁油可以调节肠道菌群结构，起到通便的作用［9］。玄参、生地黄、麦冬三药组成增液汤，有“寓泄于补，增水行舟”之效。现代药理学研究表明，麦冬中的麦冬多糖可以促进小鼠肠道菌群多样性，增强肠道益生菌的增殖［10］。三药都可增强其免疫力［11-13］。肉苁蓉不仅归于肾经，亦归于大肠经，可增强润肠通便之力，又不失其补肾益精之功。甘草调和诸药。

血管活性肠肽（VIP）为研究最为深入的肠神经递质之一，可以介导广泛的胃肠道功能，如调节胃酸分泌、肠道阴离子分泌、胰腺酶释放、细胞运动、血管扩张和肠道运动等。可以增加细胞内环磷酸腺苷（cAMP），从而激活蛋白激酶A（PKA），此外，VIP 还增加调节性T 细胞的产生，同时抑制巨噬细胞的促炎作用，从而有助于其抗炎作用［14］。这可能就是益气润肠方各剂量组炎性细胞浸润减轻的原因。虽然VIP 为抑制性肠神经递质，但有研究表明，VIP 含量降低，可能会减弱结肠的有效推动［15］。

水通道蛋白（AQPs）在人体的水运输系统中扮演着重要角色，目前已发现13 种，早期研究中发现，其中的AQP3 在大鼠结肠中的分布和人相似［16］。AQP3 在结肠中的表达水平在渗透性泻药和刺激性泻药的通便作用中起着重要作用［17］。研究发现，细胞内 Mg2+浓度升高可激活AC－cAMP－PKA 信号通路，从而导致AQP3 基因表达长期上调，为MgSO4导泻机制之一［18］。大黄素可以上调AQP3 的表达水平从而达到通便的作用［19］，占煜等［20］认为众多药物通便的生物学基础可能是通过调控细胞膜上AQP3 的表达来调节水运输的效率，进一步对结肠的水液代谢产生影响。VIP 可调控AQP3表达水平，是通过cAMP/PKA通路实现的［21-22］。

综上所述，益气润肠方治疗便秘，其机制可能是通过调控VIP－cAMP－PKA－AQP3 信号通路来实现的。值得思考的是，目前许多研究VIP－cAMPPKA－AQP3 信号通路的表达水平与便秘关系的研究结果不甚一致，还需进一步探讨。