DNA 条形码在三峡库区鱼类多样性研究中的应用

贺杨，陈文俊，陈洁琼，曾文文，张雪晶，杨婷，翟东东， ，刘红艳， ，熊飞， ，王莹，

（1. 江汉大学生命科学学院，湖北省汉江流域特色生物资源保护开发与利用工程技术研究中心，武汉 430056；2. 江汉大学持久性有毒污染物环境与健康危害湖北省重点实验室，武汉 430056）

三峡工程是世界上最大的水利工程之一，1997 年实现长江截流，经过多次蓄水，库区水位由135 m 上升到175 m（杨志等，2015）。三峡大坝的建设使位于重庆市东部和湖北省宜昌市西部之间形成了长约600 km、面积约1 084 km2的峡谷河道型水库。已有研究成果表明，三峡水库蓄水后，库区水生生境由原来单一的河流生境转变为静水-缓水-流水梯次排列的复杂生境，使库区鱼类物种数急剧减少，鱼类群落结构也发生了显著变化（Yanget al.，2012；邹家祥，翟红娟，2016；Gaoet al.，2019；魏念等，2021）。20 世纪80 年代前，三峡库区江段有140～200 种 鱼 类（Fanet al.，2006）；吴 强 等（2006）在三峡库区长江干流及主要支流共监测到鱼类108 种。董纯等（2019）在三峡库区干流鱼类资源现状与物种多样性保护的调查中获得84种鱼类。因此，全面了解三峡库区现有鱼类组成和评估鱼类的遗传多样性并提出保护措施非常必要。

自2006 年建立鱼类条形码数据库Fish-BOL（http：//www.fishbol.org）以来，鱼类DNA 条形码数据量呈指数级上升（Ward，2012）。不少研究显示DNA 条形码技术能很好地进行鱼类物种鉴定：Khedkar 等（2014）基于印度纳尔默达河流域314 条鱼类的COⅠ条形码，发现5 个隐存种和43 种该地区未报道鱼类；Chen等（2015）研究了怒江1 139个样品的COⅠ条形码，建立了怒江鱼类DNA 条形码数据库，验证了COⅠ条形码在鱼类鉴别上的可行性；Wang 等（2021）探讨了DNA 条形码技术在向家坝库区鱼类鉴定中的应用；郜星晨和姜伟（2021）初次构建了三峡库区常见小型鱼类DNA 条形码数据库，但其研究的物种数目较少。

本研究一方面利用DNA 条形码技术对三峡库区渔获物进行鉴定，探讨DNA 条形码在三峡库区鱼类辅助鉴定中的适用性，构建三峡库区鱼类DNA 条形码数据库，另一方面对一些鱼类进行了初步的遗传多样性分析，以期为三峡库区鱼类资源监控、保护和管理提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与形态学鉴定

2019 年8—11 月和2020 年5—8 月，在三峡库区及各支流（太平溪、香溪河、小江、云阳、万州、丰都、涪陵、巴南、箭滩河、涪江、嘉陵江）设置11个采样点（图1），渔具选择地笼（网目1.2 cm）和单层多网目复合刺网等。在各采样点进行捕捞、现场鉴定、记录鱼类体长及体重等生物学性状。参考《中国鲤科鱼类志》（伍献文等，1982）、《四川鱼类志》（丁瑞华，1994）和《Fishes of the World》（Nelsonet al.，2016）等对物种进行形态学鉴定。

图1 三峡库区鱼类采样点Fig. 1 Fish sampling sites in the Three Gorges Reservoir Area

共采集鱼类标本18 466 尾，为获取各物种不同地理种群的样本，选取其中946 尾PCR 扩增，每个样本取适量鳍条和肌肉保存于95%乙醇中用于COⅠ条形码分析，随后所有样品用10%甲醛溶液浸泡成标本，保存于江汉大学动物遗传学实验室。

1.2 DNA提取、PCR扩增及测序

取约100 mg 鱼类肌肉组织或鳍条，采用高盐法提取基因组DNA，COⅠ基因序列扩增引物序列为：F1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’和R1：5’-TAGACTTCTGGGTGGGCCAAAGAATC-3’（Wardet al.，2005）。PCR 反应体系（30 µL）：2×Taq Master Mix（含Taq-DNA-Polymerase、PCR-Buffer 和dNTP，上海捷瑞）10.3 µL，正、反向引物（10 mmol·L-1）各1.5 µL，DNA 模板1.5 µL，双蒸水15.2 µL。PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，31 个循环；72 ℃ 10 min；16 ℃ 20 min 或者结束后4 ℃保存。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送天一辉远生物科技有限公司完成纯化回收和序列测定。

1.3 数据分析

通过DNAStar 中的SeqMan 对测序峰图进行校对和拼接（Swindell & Plasterer，1997），获得有效的样本序列；利用MEGA 7.0 进行多序列比对和截取同源序列（Kumaret al.，2016），分析序列变异位点、信息位点、碱基组成情况，基于K2P 双参数模型计算遗传距离，可靠性经过1 000 次自举检验；通过MEGA 7.0 计算分类学分辨率（种间平均遗传距离/种内平均遗传距离）；利用DNASP 5.0 计算物种单倍型数目（Librado & Rozas，2009）；通过MrBayes 3.2.3 构建贝叶斯系统进化树（Ronquistet al.，2012），利用Tracer 1.6 检查贝叶斯推测的饱和度（Suchardet al.，2018）；通过DNASP 5.0 计算采 样点≥2，且样本量≥30 鱼类样本的单倍型数目（Nh）、单倍型多样性（h）和核苷酸多样性（π）。参考NCBI 和BOLD 数据库检索所有形态物种的COⅠ基因序列，将物种序列相似度≥97%的标本定义为同一物种（Wong & Hanner，2008），最后将测序序列提交至GenBank数据库。

2 结果

2.1 物种形态鉴定结果

946 尾标本经形态学鉴定隶属于6 目14 科55 属71 种（附录Ⅰ），鲤形目Cypriniformes 鲤科Cyprinidae 物种最多（39 种，55%），其次是鲿科Bagridae（8种，11%）。

2.2 DNA条形码序列分析

PCR 扩增获得946 条COⅠ基因序列，共计303个单倍型，去除两端不可靠的碱基后得到长度为639 bp 的COⅠ基因序列矩阵，将上述序列储存在GenBank 数据库（附录Ⅰ）。NCBI 和BOLD 数据库比对结果显示，926 尾有98.12%以上的相似性，属于66个物种；20 尾的相似性为91.34%～95.74%，鉴定到属水平，定义为5 个未命名物种，DNA 条形码鉴定率为93%。MEGA 7.0 分析表明，946 条COⅠ基因序列中包含变异位点287 个，简约信息位点273 个，平均碱基组成T（28.7%）、C（27.8%）、A（25.3%）、G（18.2%），呈A+T偏倚性。

在K2P 模型下，种内遗传距离为0～3.39%，平均为0.36%，银飘鱼Pseudolaubuca sinensis的最大，为3.39%（图2）；属内种间遗传距离为2.41%～14.83%，平均为6.88%，洞庭小鳔Microphysogobio tungtingensis与乐山小鳔Microphysogobio kiatingensis之间的遗传距离最小，为2.41%，光唇蛇Saurogobio gymnocheilus与 蛇Saurogobio dabryi的最大，为14.83%；属间遗传距离为6.25%～24.49%，平均为15.57%；科间遗传距离为13.70%～26.68%，平均为19.97%。种间遗传距离是种内遗传距离的19.11倍（表1）。

表1 三峡库区捕获的71个物种在不同分类阶元间基于K2P的遗传距离Table 1 Genetic distance of 71 species captured in the Three Gorges Reservoir Area within various taxonomic levels based on K2P

图2 三峡库区捕获的71个物种的DNA条形码间隙Fig. 2 DNA barcoding gaps of 71 species captured in the Three Gorges Reservoir Area

2.3 系统发育与遗传多样性分析

基于GTR+I+G 模型构建的303条COⅠ单倍型序列的贝叶斯系统进化树显示（图3），303 条COⅠ单倍型序列形成了71 个分支，同种序列都形成了具有较高支持率的单分支（后验概率=1.00）。在属水平上，除黄颡鱼属Tachysurus未聚为一支外，其余54 属在属水平上均各自聚为一支，支持率均为1.0。黄颡鱼属、属Leiocassis和拟鲿属Pseudobagrus聚为一支；在科水平上，鲤科的高体鳑鲏Rhodeus ocellatus、鳑鲏属未命名种Rhodeussp.和大鳍Acheilognathus macropterus未聚在鲤科大支中；在目水平上，鲈形目Perciformes 未聚成单系。结果显示，COⅠ基因序列适用于物种水平上的分类，不适用于属及更高水平的分类。

选取三峡库区优势物种鲢Hypophthalmichthys molitrix、蛇、贝氏Hemiculter bleekeri、光泽黄颡鱼Tachysurus nitidus、瓦氏黄颡鱼Tachysurus vachellii和短颌鲚Coilia brachygnathus进行遗传多样性分析（表2）。6 种鱼类480 尾标本中共有120 个单倍型，单个物种的单倍型数目为2～16个。6种鱼类在不同采样地均存在共享单倍型，其中，短颌鲚的单倍型均为共享单倍型。遗传多样性分析显示，瓦氏黄颡鱼、鲢和蛇的核苷酸多样性较高，分别为0.012 9、0.010 5 和0.008 4。贝氏、光泽黄颡鱼和短颌鲚的核苷酸多样性均小于0.002 7；最高的单倍型多样性出现在巴南的蛇种群（h=0.924），最高的核苷酸多样性出现在巴南的瓦氏黄颡鱼种群（π=0.012 9），最低的核苷酸多样性和单倍型多样性均出现在短颌鲚万州种群（h=0.186，π=0.000 3）。

表2 三峡库区捕获样本的遗传多样性信息Table 2 Genetic diversity of fish species captured in the Three Gorges Reservoir Area

3 讨论

3.1 DNA 条形码在三峡库区鱼类物种鉴定中的有效性

鱼类DNA 条形码最重要的作用就是对鱼类鉴定进行分子水平上的辅助，弥补传统形态学鉴定方法的不足，发现或纠正传统分类学中隐含的错误，为有效利用鱼类资源、保护鱼类多样性提供科学依据（McCuskeret al.，2013；Thomaset al.，2014；Wanget al.，2018；Shenet al.，2019）。本研究基于946 条DNA 条形码序列，与NCBI 和BOLD 数据库比对，鉴定出71 个物种，其中5 个为未命名种，鉴定率93%，这可能是COⅠ基因序列包含的遗传信息有限，无法对个别物种实现种水平的物种鉴定或这5个未命名种的COⅠ基因序列还未被数据库收录。Hebert 等（2003）认为评价DNA 条形码可行性的关键标准是种内遗传距离不得大于2%。本研究中，三峡库区鱼类种内遗传距离平均值为0.36%，高于北欧大陆架海洋鱼类（0.21%）（Thomaset al.，2014）、印度尼西亚石斑鱼科Epinephelidae物种（0.16%）（Fadliet al.，2021），但低于澳大利亚海洋鱼类（0.39%）（Wardet al.，2005）、墨西哥和危地马拉的淡水鱼类（0.45%）（Valdez-Morenoet al.，2009）、北美淡水鱼（0.73%）（Aprilet al.，2011）、法属波利尼西亚、留尼汪岛和马达加斯加珊瑚礁海洋鱼类（1.06%）（Hubertet al.，2012）和青藏高原高原鳅属Triplophysa鱼类（2.9%）（Liet al.，2017），这可能与鱼类频繁的基因交流和环境同质性有关。本研究属内种间平均遗传距离（6.88%）是种内平均遗传距离（0.36%）的19.11 倍，符合Hebert 等（2003）提出的种间平均遗传距离必须大于种内遗传距离10倍以上的标准。最大种内遗传距离均显著小于其最小种间遗传距离，能形成明显的DNA条形码间隙；贝叶斯系统进化树中71 种鱼类均形成各自的分支，且支持率较高。因此，利用线粒体COⅠ基因作为DNA 条形码进行三峡库区鱼类物种鉴别是可行的。

3.2 DNA条形码在属及属水平以上分类不适用

在属及属水平以上没有准确的种群分类可能是由于线粒体COⅠ基因序列的DNA 条形码信息位点有限，在高级阶元时碱基置换趋于饱和未能解析更高分类水平的系统发育关系，提示需要探索更多兼具保守性和差异性的DNA 序列来实现物种分类和鉴别（彭居俐等，2008）。

3.3 三峡库区鱼类遗传多样性

核苷酸多样性指数和单倍型多样性指数是衡量一个物种群体遗传多样的重要指标（Vrijenhoek，1994）。遗传多样性越高，对环境的适应能力越强，其进化潜力就越强（王瑾瑾等，2014）。本研究中太平溪、箭滩河和万州的鲢种群、巴南和小江的瓦氏黄颡鱼种群、巴南和香溪河的蛇种群呈高的单倍型多样性和核苷酸多样性，可能是这些物种在其采样地拥有较稳定且持续壮大的种群或在种群演化过程中异域分化的谱系出现了二次交流，积累了大量的核苷酸突变。万州的蛇种群、巴南和万州的光泽黄颡鱼种群、巴南、太平溪和万州的贝氏种群呈较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性，可能是这些种群在历史上经历了瓶颈效应，后来种群发生了快速扩张。太平溪和万州的短颌鲚种群呈较低的单倍型多样性和核苷酸多样性。据历史文献资料记载，短颌鲚主要分布在长江及淮河流域的中下游地区，及与长江流域相通的淡水湖泊（袁传宓，秦安舲，1984），截至2015 年未见短颌鲚在三峡库区分布的记录（杨丽亚等，2022）。三峡大坝的建立使三峡库区由急流水生境变为缓流水生境（Gaoet al.，2010），迫使喜急流鱼类向上游迁移，原有鱼类的繁殖和摄食也受到影响，造成库区生态位空缺（陈辙聿等，2022），为短颌鲚提供了适宜的栖息生境，三峡库区的短颌鲚种群可能是中下游的短颌鲚种群通过葛洲坝、三峡大坝船闸扩散到三峡库区形成的新种群（Yanget al.，2019；Zhaiet al.，2022）。为防止三峡库区鱼类遗传多样性遭到更严重破坏，应对短颌鲚等外来入侵种群开展科学动态监测和风险评估等相关研究，以期为库区鱼类种群生物多样性保护和资源种群的科学管理提供技术支撑。