基于网络药理学探究麻黄附子甘草汤治疗冠心病的作用机制

王硕 张晋 邱昌龙

华北理工大学中医学院 河北唐山 063000

麻黄附子甘草汤作为仲景经方的代表,在《伤寒论》、《金匮要略》中均有论述。《伤寒论》302条有云:“少阴病,得之二三日,麻黄附子甘草汤微发汗。以二三日无里证,故微发汗也。麻黄附子甘草汤方,麻黄二两(去节),甘草二两 (炙),附子一枚 (炮,去皮),右三味,以水七升,先煮麻黄一两沸,去上沫,内诸药,煮取三升,去滓,温服一升,日三服[1]。”《金匮要略水气病脉证并治第十四》中16条原文则说:“水之为病,其脉沉小,属少阴;浮者为风,无水虚胀者为气;水,发其汗即已。脉沉者宜麻黄附子汤;浮者宜杏子汤。麻黄附子甘草汤方,麻黄三两甘草二两,附子一枚(炮),右三味,以水七升,先煮麻黄,去上沫,内诸药,煮取二升半,温服八分,日三服[2]。”原文两方组成各有不同,历代医家纷述颇多,但针对原文方药论述的使用结合仲景方药理论认识,诸多医家提出了本方病症及方药配伍使用的分析,例如,闫朝光等[3]认为麻黄附子甘草汤主要治疗少阴寒化、脉微、手足凉且无明显里证表证的病症态。刘宾[4]就认为麻黄附子甘草汤证的主要病机为肝胆枢机不利,中下二焦 (即少阴心肾、足太阴脾)不足,病位在太阳、少阴,外感风寒循经入里但未化热,出现脉沉,津液输布不畅出现水肿,阳气亏虚的同时伴有阳气虚浮存在,方用甘草敛降浮阳,炮附子温补下焦,麻黄宣散肝胆气机,促阳气外达以祛风寒。三药配伍,共同起到散寒不伤正气、敛降以防虚浮的目的”。而在临床实践中,依据麻黄附子甘草汤证方证特点,在经方原文的基础上,不断扩大临证疾病范围,逐步形成了麻黄附子甘草汤临床应用特点,例如程广里[5-6]老先生在临床治疗中就发现冠心病尤其出现心动过缓、心律不齐、低血压时使用麻黄附子甘草汤效果佳。万迎来[7]老先生运用麻黄附子甘草汤加减治疗怔忡(病毒性心肌炎导致的心动过缓、房室传导阻滞)、内伤失音症、水肿等病效果较好。

冠心病(coronary heart disease简称CHD)是冠状动脉粥样硬化病变引起的血管管腔狭窄甚至阻塞而造成心肌梗死、心律不齐、心动过缓等症状的常见多发慢性病之一。我国CHD患者人数持续上升且逐渐年轻化[8]。《中国心血管健康指数2023版》(CHI) 指出中国心血管健康7年提高10分,要想继续提高甚至接近满分,更应从治未病角度来改善心血管健康状况入手,中医药可以发挥更大的作用[9]。本文结合诸多医家认识,以麻黄附子甘草汤和冠心病作为研究对象,运用网络药理学进行其相关机制的探究,现报告如下。

1 资料与方法

1.1麻黄附子甘草汤方中药物主要活性成分及靶点的筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台即TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)分别搜索麻黄、附子、甘草并且以口服生物利用度(OB)≥30%[10]和类药性(DL)≥0.18[11]为条件筛选出药物活性成分的靶点。在PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中用TCMSP的CAS号找到Canonical SMILES结构,并在Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)中找到核心靶点,无对应的可以在UniProt(https://www.uniprot.org/)中找出相对应的Uniprot id和Common name,最后在Excel表格中删除除重复靶点,得到方中药物活性成分的靶点并保存。

1.2疾病靶点收集 在Gene Card(https://www.genecards.org/)、Disgenet(https://www.disgenet.org/)、OMIM(https://omim.org/)和TTD(https://db.idrblab.net/ttd/)四个数据库中用关键词“coronary heart disease”筛选出冠心病的相关靶点,并通过Uniprot数据库进行标准化处理。

1.3药物-疾病靶点收集 用交集映射的方式得到麻黄附子甘草汤及冠心病的共同靶点,并在微生信平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)中制作出相应的Venn图。

1.4构建麻黄附子甘草汤-冠心病的PPI网络 在STRING(https://cn.string-db.org/)数据库中输入交集靶点种类为“Homo sapiens”,最小互交分数设为0.400,得到PPI网络图。在Cytoscape3.9.1软件中输入交集靶点在CytoNCA插件中选择Degree,得到Degree值从大到小排列的靶点,再根Degree值分层做PPI可视图,Degree值越大图像越大越靠近核心区域。

1.5构建疾病-药物-活性成分靶点图 在Excel中分类整理各个中药对疾病发挥作用的靶点并传入到Cytoscape3.9.1软件构建疾病-药物-活性成分靶点图。

1.6GO富集分析、KEGG通路分析 将共同作用靶点录入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)中得到富集分析数据并根据P值由大到小分别筛选出部分条目,利用微生信平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)绘制GO富集分析条状图和KEGG通路分析气泡图。

2 结果

2.1方中药物活性成分 共对CHD发挥作用的活性成分118个,其中附子有6个,麻黄有23个,甘草有89个,各中药口服生物利用度前3位的主要活性成分为甘草:甘草酚、甘草酸、甘草吡喃香豆素。麻黄:圣草酚、白天竺葵苷、儿茶素。附子:乌头碱、去甲乌头碱、水黄皮素。

2.2药物-疾病靶点Venn图的建立 药物的活性成分经过Uniprot标准化处理后得到245个有效靶基因,在 Gene Card、Disgenet、OMIM和TTD数据库中得到CHD的靶点基因6818个,以此构建Venn图,获得189个麻黄附子甘草汤治疗冠心病的共同靶基因,见图1。

图1 附子甘草汤治疗冠心病的共同靶基因

2.3PPI关键基因靶点图及分析 把交集靶点输入STRING数据库中得到PPI网络图,见图2,其中包括140个节点1826条边。再把导出的文件输入到Cytoscape3.9.1软件内得到Degree值分层图,见图3。由图可以预测出189个关键靶点中Degree值排名前10的靶点有RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、肿瘤坏死因子、白细胞介素-6、白细胞介素-1β、TP53结合蛋白1、雌激素受体、基质金属蛋白酶-9、半胱天冬酶-3、信号换能器和转录激活器 3、前列腺素 G/H 合酶 2。

图2 PPI网络图

图3 Degree值分层图

2.4疾病-药物-活性成分靶点图的构建 在Excel中分类整理得到麻黄作用于CHD有276个关键靶点,甘草作用于CHD有1063个关键靶点,附子作用于CHD有9个关键靶点,把汇总的靶点传入到Cytoscape3.9.1软件构建疾病-药物-活性成分靶点图,见图4。图中三角形代表疾病CHD,圆形代表单味中药及其活性成分,箭头代表交集靶点基因。

图4 疾病-药物-活性成分靶点图

2.5GO富集分析 进行GO富集分析后,参与生物学过程(BP)的有762条,细胞组分(CC)98个,分子功能(MF)142个。根据PValue值由大到小进行排列后选取前10位进行可视化作图。图中横坐标为GO名称,绿色代表BP,橘色代表CC,紫色代表MF,纵坐标为富集的基因数,见图5。结果显示麻黄附子甘草汤在治疗CHD时作用靶点参与生物学过程主要富集在对基因表达的正向调节;对细胞凋亡过程的负向调节;对异生物刺激的反应;对转录的正向调节及DNA诱导;细胞对缺氧的反应;对细胞增殖的正向调节;对RNA聚合酶II启动子转录的正向调节;对细胞凋亡过程的正向调节;对细胞迁移的正向调节。细胞组分主要分布在大分子复合体、质膜蛋白复合物、线粒体、RNA 聚合酶 II 转录因子复合体、突触后膜、浆膜等。富集比较明显的分子功能酶结合、RNA 聚合酶 II 转录因子活性、配体激活的序列特异性 DNA 结合、同源蛋白结合、蛋白同源二聚化活性、转录因子活性、 细胞因子活性、类固醇激素受体活性、蛋白激酶结合等方面有关。

图5 根据PValue值由大到小进行排列后选取前10位进行可视化作图

2.6KEGG富集分析 KEGG富集分析得到178条通路,按照富集基因数进行排列后对基因数前25的条目进行可视化处理图6,其中气泡越大表示富集基因越多,气泡越小表示富集基因越少,气泡的颜色代表P值大小。结果表明,麻黄附子甘草汤治疗CHD的靶点主要集中在癌症通路、脂质与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路,乙型肝炎,流体剪切应力与动脉粥样硬化,IL-17信号通路,PI3K-Akt信号通路,Th17细胞分化,非小细胞肺癌,内分泌抵抗,TNF信号通路等多种途径。

图6 按照富集基因数进行排列后对基因数前25的条目进行可视化处理

3 讨论

在中医学中CHD属于“胸痹”的范畴,《金匮要略》将胸痹的病机概括为阳微阴弦,总为上焦阳气衰微,阴邪上犯。CHD可以属于“胸痹”“心痛”“真心痛”等的范畴之中[12]。随着环境及生活习惯的变化,近来众多研究及临床实践证明,中医认为本病发生多基于痰、瘀、热、寒、郁[13]。

麻黄附子甘草汤由麻黄、附子、甘草三味药物组成,其中麻黄最早记载于《神农本草经》是麻黄科植物,包括草麻黄、中麻黄、木贼麻黄的草质茎干燥制品[14],有发汗解表、宣肺平喘、利水消肿、散寒通滞之功效[15]。麻黄的主要成分是生物碱,其中麻黄碱有类似肾上腺素的交感神经兴奋作用,因此其发汗、平喘、利尿、升压、抗过敏以及胰岛素样等兴奋中枢的作用与其化学成分如麻黄碱、挥发油和多糖有关[16];此外麻黄还有镇痛、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、免疫抑制、兴奋中枢神经系统、抗炎、抗病毒和抗菌、抗病原微生物、降血糖、促进脂肪细胞脂肪合成等药理作用[17]。附子最早记录于《神农本草经》,书中有言:“附子,一名莨,味辛,温,有大毒。主风寒咳逆邪气,温中,金疮,破癥坚,积聚,血瘕,寒湿踒躄,拘挛,膝痛, 不能行步。生山谷”,张仲景善用附子,多用于阳虚阴寒湿盛证候,印证了上述附子的功效特点,可散寒气,助阳气[18];本品有强心、扩张血管、镇痛、抗炎、抗溃疡、抗肿瘤、增强免疫、抗缺氧、抗寒冷等多种药理作用[19]。麻黄-附子配伍,可有效抑制溶出两者的有效成分,提升麻黄生物碱和苯甲酰乌头原碱的生物利用度,新生成的单酯型生物碱含量降低,毒性降低,且具有抗炎、镇痛的作用。麻黄-甘草配伍使用不仅可以减毒,还可以增效[20]。张仲景善用甘草,甘草用方在《伤寒论》中占62.5%,在《金匮要略》中占36.6%,具有补脾益气、止咳、缓急止痛、清热解毒、调和诸药的功效[21]。甘草有抗消化性溃疡、保肝、解痉、抗心律失常、镇咳祛痰、解毒、抗炎、抗菌、抗病毒、抗变态反应、肾上腺皮质激素样作用以及抗肿瘤、抗突变等多种药理作用[19]。

本研究是通过网络药理学的方法预测麻黄附子甘草汤治疗CHD的主要机制,通过对药物活性成分的探究发现甘草口服生物利用度排名前3位的主要活性成分甘草酚、甘草酸具有抗炎抗氧化从而增加冠脉血流、稳定斑块等保护心肌的作用,甘草吡喃香豆素可以有效保护神经,调节交感神经和副交感神经从而保护心脏。麻黄中圣草酚是一种黄酮类天然产物,具有抗氧化、抗炎和抗糖尿病作用还可以诱导Nrf2信号通路从而起到防止CHD的作用;白天竺葵苷是从白细胞介素中分离出来的,有激活、调节免疫细胞,介导T、B细胞活化、参与炎症反应和细胞增殖与分化从而促进心血管损伤修复;儿茶素具有抗心血管、抗肿瘤、抗肥胖、抗糖尿病、抗感染、保肝和神经保护作用。附子的活性分:乌头碱、去甲乌头碱可以抑制炎症介质的释放改善毛细血管通透性;水黄皮素属于黄酮类物质,可以通过对心肌细胞膜产生影响发挥保护心肌的作用。

在PPI关键蛋白中我们探究得知RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶可以促进血管生成,调节细胞代谢、增殖存活;肿瘤坏死因子可以调节T细胞反应进而作用于活化的T淋巴细胞和内皮细胞,促进血管内皮修复;白细胞介素-6可以作用在免疫、组织再生和代谢方面;白细胞介素-1β促炎细胞因子,可以诱导前列腺素合成、中性粒细胞内流和活化、T细胞活化和细胞因子产生、B细胞活化和抗体产生,以及成纤维细胞增殖和胶原蛋白产生;TP53结合蛋白1在DNA损伤修复中参与双链断裂蛋白修复;雌激素受体属于类固醇激素,参与细胞增殖和分化;基质金属蛋白酶-9在细胞外基质的局部蛋白水解和白细胞迁移中起重要作用;半胱天冬酶-3参与细胞凋亡;信号换能器和转录激活器 3是炎症反应的调节剂还可以参与细胞凋亡;前列腺素 G/H 合酶 2可以促进前列腺素产生,在炎症反应中具有重要作用。

GO富集后可以观察到CHD的生物过程主要与对基因表达的正向调节、对细胞凋亡过程的负向调节、对异生物刺激的反应、细胞对缺氧的反应、对细胞增殖的正向调节等相关。这说明麻黄附子甘草汤在促进心肌细胞和血管再生、控制炎症反应等方面发挥重要作用。KEGG富集后分析显示麻黄附子甘草汤治疗CHD的主要作用通路富集于脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化、 IL-17信号通路、细胞凋亡等,这些通路在保护心肌,促进细胞血管再生,降低动脉粥样硬化方面有积极作用。

本研究通过网络药理学的方法预测麻黄附子甘草汤治疗CHD的主要机制,得出结论麻黄附子甘草汤是多成分、多靶点、多途径对冠心病进行治疗,体现了经方治疗的优越性。但由于数据库的信息尚不完全,且该研究仅在理论上证明其有效性,尚需要进一步完善动物试验及临床治疗效果统计。