EDTA依赖性血小板减少症血小板解聚方法在不同血细胞检测系统的效果评价

钟阳,李颖能,张伟红(广州市第一人民医院检验科,广州510180)

EDTA依赖性假性血小板减少症(EDTA-dependent pseudo-thrombocytopenia,EDTA-PTCP)是由于在EDTA抗凝血中EDTA诱导血小板(platelets,PLT)中的特殊蛋白使PLT发生凝集导致PLT发生假性减少的现象[1]。虽然这种现象发生的几率很低(0.07%～1%)[2],但却给临床诊治工作带来很大困扰,既容易造成误诊又延误时效,继而增加患者的经济负担[3]。目前临床多应用电阻抗法(PLT-I法)对存在EDTA-PTCP现象的患者血液标本进行检测,但考虑到存在不同程度的PLT聚集反应,PLT-I法的PLT数值常低于实际值,最终无法提供数据参考[4-5]。针对这种现象,临床上提出使用枸橼酸钠、肝素钠等其他抗凝剂替代EDTA-K2进行抗凝以解决EDTA-PTCP的PLT聚集现象[6],也有人提出在血中加入一定浓度的丁胺卡那霉素进行解聚[7-8]。近几年,随着血细胞分析仪的快速发展,有文献报道迈瑞BC-6800 Plus(具有解聚功能)的荧光染色法(PLT-O法)对EDTA-PTCP患者的全血进行检测时,能够纠正PLT聚集[9-10]。本研究通过不同方法对25例EDTA-PTCP患者样本中聚集PLT的PLT-O法解离效果进行比较,为实验室处理EDTA-PTCP样本提供参考。

1 材料与方法

1.1标本来源

1.1.1非EDTA-PTCP组 收集50例PLT高(PLT>300×109/L)、中(100×109/L≤PLT≤300×109/L)、低(PLT<100×109/L)值分布,检测仪器无PLT报警且镜检无聚集,无白细胞、红细胞碎片干扰的住院患者EDTA-K2抗凝静脉血,每份标本2 mL,检测时间不超过4 h,其中男29例,女21例,年龄1～91岁,平均年龄57岁。

1.1.2EDTA-PTCP组 收集2020年1月至2021年4月PLT<100×109/L或在7天内百分比减少50%静脉血标本;观察标本状态,排除因凝块造成的假性PLT减低;推片染色,镜检发现有PLT聚集符合诊断为EDTA-PTCP的25例患者的EDTA-K2抗凝静脉血,其中男11例,女14例,年龄26～98岁,平均年龄58岁。EDTA-PTCP组患者均进行确认实验,患者在血细胞分析仪旁重新抽血置于EDTA-K2抗凝管中,若PLT数值随标本放置时间延长而下降且血涂片有血小板聚集则可确认为EDTA-PTCP患者。

参与本次研究的患者均签署患者知情同意书,并得到广州第一人民医院伦理委员会的批准(批准文号:K-2019-176-01)。

1.2试剂和仪器 静脉血无抗凝、EDTA-K2抗凝、枸橼酸钠抗凝、肝素抗凝真空采血管由广州阳普医疗用品公司提供;丁胺卡那霉素由齐鲁制药公司生产;瑞氏-吉姆萨复合染液由BASO公司提供;Olympus双目显微镜;SysmexXE-5000血细胞分析仪(XE-5000)和MindaryBC-6800 Plus(BC-6800 Plus)血细胞分析仪均使用原厂配套试剂和质控品。

1.3实验方法

1.3.1实验前准备 严格按照仪器说明书操作,操作前用配套的质控物和校准品进行质控和校准,设置XE-5000检测模式为:CBC+DIFF+NRBC+RET,BC-6800 Plus检测模式为:CDR。

1.3.2实验操作 将非EDTA-PTCP组的标本颠倒混匀后分别在XE-5000和BC-6800 Plus上进行检测,记录PLT结果。对于EDTA-PTCP组的标本,联系患者血细胞分析仪旁抽血,无抗凝剂管、肝素钠抗凝管、枸橼酸钠抗凝管各1管,EDTA-K2抗凝管3管(A、B、C管),每管2 mL静脉血,采血过程严格依照操作规程进行。无抗凝剂管于XE-5000即时检测(尽快检测,避免血液发生凝固),用此检测所得PLT数值为患者的准确PLT数值;肝素抗凝管、枸橼酸钠抗凝管及EDTA-K2抗凝A管在不同时间段(即时、0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h),先后在XE-5000和BC-6800 Plus上按照EDTA-K2抗凝A管、肝素抗凝管、枸橼酸钠抗凝管的顺序分别在XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-I和PLT-O模式下检测PLT数值并进行血片观察;患者EDTA-K2抗凝B、C管分别放置不同时间段(0.5 h、1.0 h)测定PLT数值后,两管均加入浓度为100 mg/mL丁胺卡那霉素100 μL,加入丁胺卡那霉素后放置不同时间段(1.0 h、2.0 h、3.0 h)进行解离并先后在XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-I和PLT-O模式下测定各管PLT数值并进行血片观察。

1.4数据处理及统计方法 EDTA-K2、肝素、枸橼酸钠3种抗凝管在不同时间段的检测结果以无抗凝剂管即时检测结果进行标准化处理,处理后的结果变成无抗凝管即时检测值的解聚率和聚集率,标准化处理公式如下(Xi:3种抗凝管在不同时间段的检测结果;X无抗凝剂:无抗凝剂管即时检测结果;y1:处理后聚集率的结果;y2:处理后解聚率的结果):y1=(Xi-X无抗凝剂)/X无抗凝剂,y2=Xi/X无抗凝剂。

2 结果

2.1XE-5000与BC-6800 Plus对非EDTA-PTCP组PLT检测结果比对 非EDTA-PTCP组50例样本中,16例高值PLT,17例中值PLT,17例低值PLT,XE-5000与BC-6800 Plus的PLT-O检测PLT的结果相关性较好,偏差较小,结果见图1。

注:A,C分别是XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-I检测模式和对非EDTA-PTCP组的50例样本PLT数值的Passing-Bablok回归分析和Bland-Altman偏差分析,B,D分别是XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-O检测模式对非EDTA-PTCP组的50例样本PLT数值的Passing-Bablok回归分析和Bland-Altman偏差分析。

2.2实验组结果

2.2.13种抗凝剂对EDTA-PTCP患者PLT的影响 用XE-5000的PLT-O通道检测EDTA-PTCP组25例标本的3种抗凝剂管中PLT聚集率,均随标本放置时间延长而上升,表明对这25例标本来说,更换抗凝剂不会帮助血细胞分析仪对PLT的准确计数,放置各时间段后,血片上均可见PLT聚集,且随时间延长,PLT聚集更严重,说明更换抗凝剂无法解决此25例EDTA-PTCP的PLT聚集。

2.2.2EDTA-K2抗凝管在各时间段PLT检测结果与无抗凝剂管即时PLT检测结果比对 将各时间段XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-O通道对A管检测结果与无抗凝剂管即时检测结果进行比对,XE-5000对A管即时检测与无抗凝剂管即时检测的结果无显著差异(P>0.05),放置其他时间段(0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h)检测结果均有显著差异(P<0.05);在1 h内BC-6800 Plus对A管检测结果与无抗凝剂管即时检测结果无显著差异(P>0.05),放置2.0 h、3.0 h检测结果均有显著差异(P<0.05),结果见表1。BC-6800 Plus对A管在各时间段的PLT解聚率均大于XE-5000,见图2。

表1 EDTA-K2抗凝管在各时间段PLT-O检测结果与无抗凝剂管即时PLT检测结果比对

图2 EDTA-K2抗凝管在各时间段的PLT解聚率检测结果

2.2.3不同时间内加入丁胺卡那霉素后各模式下PLT聚集情况结果比对 对于XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-O检测模式,BC-6800 Plus对不加丁胺卡那霉素(A管)和分别放置0.5 h和1 h后加入丁胺卡那霉素(B管和C管)抗凝管的各时间段PLT检测结果相比于XE-5000更加接近准确值(即时检测值);对于不同时间加入丁胺卡那霉素的结果,抽血后放置0.5 h加入丁胺卡那霉素的解离效果稍微优于抽血后放置1 h加入丁胺卡那霉素的解离效果,两者解离的PLT数值在2 h以后趋于稳定。结果见表2、表3和图3。

表2 EDTA-K2抗凝管放置0.5 h加入丁胺卡那霉素(B管)后检测PLT-O结果与无抗凝剂管即时检测PLT结果比对

表3 EDTA-K2抗凝管放置1 h加入丁胺卡那霉素(C管)后检测PLT-O结果与无抗凝剂管即时检测PLT结果比对

图3 XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-O模式对不同时间加入丁胺卡那霉素样本的PLT解聚率

3 讨论

根据国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐,全血细胞技术抗凝剂宜用EDTA,它与水相中的钙离子形成稳定的螯合物而阻止血液凝固,但随着EDTA在临床检验科的广泛应用,关于EDTA可诱导PLT发生体外异常聚集的报道也逐渐增多[6]。这种现象的发生会造成误诊又延误时效,增加患者的经济负担,给临床诊治工作带来很大困扰[6]。为此,寻找准确计数此类患者血液中的PLT的最佳方案尤为重要。

面对EDTA-PTCP样本,临床上通常采用更换抗凝剂重新采血的方法[2]。根据2.2.1的结果,本研究的25例标本更换为肝素或枸橼酸钠抗凝剂,其中的PLT数值依旧随放置时间延长而下降,放置各时间段后,血涂片上也可观察到PLT聚集现象。为进一步探索EDTA-PTCP标本的解聚方法,迈瑞BC-6800 Plus中的PLT-O通道可以通过荧光试剂中的“解聚物质”和形成涡流破坏PLT聚集[9-10]。本研究通过XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-O通道检测模式对非EDTA-PTCP组的50例标本测试,其结果差异无统计学意义,表明两台仪器对非PLT聚集标本的PLT-O检测结果相关性好。对放置各时间的EDTA-K2抗凝管(A管)标本,BC-6800 Plus的PLT-O法对PLT的检测结果均比XE-5000更接近真值,其解聚率也均大于XE-5000。为探索其他PLT解聚的效果,丁胺卡那霉素对聚集PLT具有解离作用,EDTA-K2抗凝管(B管)抽血后放置0.5 h加入丁胺卡那霉素的解离效果略优于抽血后放置1 h加入丁胺卡那霉素(C管)的解离效果,两者解离的PLT数值在2 h以后趋于稳定;B、C两管加入丁胺卡那霉素后于BC-6800 Plus的PLT-O检测模式效果优于在XE-5000的PLT-O检测模式上,解聚后的PLT数值更接近于患者准确PLT计数值。

对EDTA-PTCP的患者,建议联系患者于血细胞分析仪旁即时检测获得准确的PLT数值,若患者因某种原因无法做到即时检测,可考虑在抽血后1 h内用BC-6800 Plus检测或1 h内尽快加入丁胺卡那霉素进行解离并尽快送至检验科检测。