血浆钙浓度对活化部分凝血活酶时间及其凝固曲线的影响

刘婷,花璇,叶响,裴兵(宿迁市第一人民医院检验科,江苏宿迁223800)

活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)是测定内源性凝血系统较为灵敏和最为常用的筛选试验[1-2]。临床上测定APTT是将待测血浆加入部分凝血活酶试剂,预温一定时间后加入氯化钙溶液,从而在钙、激活剂以及内源性凝血因子的作用下开始凝固反应,同时仪器通过整个反应过程中透射光强度的变化形成的凝固曲线来监测整个反应的过程。钙作为样本的抗凝靶点,需要外源性加入。实际工作中会遇到高钙血症患者APTT结果测不出以及凝固曲线报警的现象[3-4],因此本研究主要探讨血浆钙浓度对APTT数值及其凝固曲线的影响。

1 材料与方法

1.1标本来源及处理 收集宿迁市第一人民医院2021年10月门诊及住院患者枸橼酸钠抗凝血标本。每次选取20例常规凝血实验结果正常的标本,患者年龄20～60岁,男女比例0.7～1.5,排除感染、肿瘤、创伤、术后妊娠、自身免疫病等,标本性状要求无溶血、凝块、黄疸和脂血等。各取200 μL血浆合并到同一容器制备混合血浆,然后再次以离心力1 500×g离心15 min[2-5]。患者清晨空腹采集静脉血,3.8%枸橼酸钠抗凝,混合血浆2～4 h完成测试。重复上述操作7次。

1.2方法 APTT及血浆钙测定:制备混合血浆后,以离心力1 500×g离心15 min,分离上层血浆,取9个离心管,每管注入血浆200 μL,分别加入0.025 mol/L氯化钙溶液0、5、10、15、20、25、30、35、40 μL充分混匀,上机检测血浆钙浓度和对应APTT。血浆钙浓度采用偶氮砷Ⅲ法检测,试剂批号为AUZ 9582,质控品批号1223UE、1496UN,AU5800全自动生化仪以及配套试剂购于贝克曼公司。APTT采用凝固法检测,试剂批号562654,质控品批号507791、556724,Sysmex CS5100自动凝血分析仪配套试剂以及质控品购于Sysmex公司。

2 结果

2.1不同血浆钙浓度对APTT及各时期检测结果影响 见表1。不同血浆钙浓度下的APTT、凝血因子激活期时间差异有统计学意义(P<0.01),但纤维蛋白生成期时间差异无统计学意义。随着血浆钙浓度逐步增高,血凝仪出现不同报警信息影响APTT测定。

表1 加入不同体积氯化钙溶液APTT以及各阶段的检测结果

表1显示,在APTT测定的不同时期中,凝血因子激活期时间随血浆钙浓度升高而缩短,且差异有统计学意义,而对纤维蛋白生成期时间无明显影响,差异无统计学意义,说明在APTT测定过程中钙多对凝血因子激活期产生影响。与此同时发现,随血浆钙浓度逐步增高,血凝仪出现不同报警信息影响APTT测定。

加入氯化钙溶液体积20 μL时,1次实验报警早凝反应。加入氯化钙溶液体积25 μL时,3次实验报警早凝反应,1次实验同时报警早凝反应、起始角度1错误。加入氯化钙溶液体积30 μL时,3次实验报警早凝反应,1次实验同时报警早凝反应、起始角度1错误,3次实验报警不凝固。加入氯化钙溶液体积35 μL与40 μL时,凝固曲线均报警不凝固。可见随着血浆钙浓度的增高,APTT凝固曲线逐渐左移(见图1)。所取实验结果为未报警凝固曲线对应的APTT值,以及只报警早凝反应凝固曲线对应的APTT值。

注:红色、黑色、蓝色、绿色、紫色分别代表一次实验中氯化钙溶液加入0、15、20、25、30 μL时APTT的凝固曲线。

2.2临床案例 临床工作中的2例临床化学钙异常的凝血结果相一致。临床案例一:肝癌骨转移患者APTT测定的凝固曲线报警信息为不凝固,钙浓度为4.4 mmol/L,临床采取纠正措施后APTT时间为27.4 s。临床案例二:多发性骨髓瘤患者的APTT凝固曲线,报警信息为早凝反应,钙浓度为3.66 mmol/L,临床采取纠正措施后APTT时间为25.1 s。

3 讨论

APTT作为内源性凝血系统的常规筛查指标,是指从因子Ⅻ到因子Ⅹ的激活继而生成凝血酶原复合物再到纤维蛋白生成的过程。正常APTT的凝固曲线可人为分成3个时期:凝血因子激活期(从钙试剂加入启动内源性凝血途径到纤维蛋白开始生成即1%凝固点对应的时间)、纤维蛋白生成期(从纤维蛋白开始生成即1%凝固点对应的时间到纤维蛋白原全部转化为纤维蛋白即100%凝固点对应的时间)和平台期(纤维蛋白全部生成透光强度不再变化的阶段即100%凝固点之后对应的时间)[6-7]。

血凝仪不同报警信息代表不同状态:早凝反应是以8%凝固点对应的时间小于16.8 s而设定的报警阈值,起始角度1错误是4～8 s透射光强度变化(dH)大于48小于600而设定的报警阈值,不凝固是整个凝固反应中dH<90而设定的报警阈值。一般情况下,dH<90代表血浆在检测时间内未发生凝固反应。仪器测定APTT时,凝固曲线生成是从氯化钙溶液加入时开始,如果血浆钙浓度增高到一定程度,就相当于提前于仪器加入氯化钙溶液而仪器并未能监测到此刻凝固反应形成的凝固曲线,以至于当仪器真正开始加入氯化钙溶液时其所监测到的凝固曲线为整个凝固反应的一部分,而随着血浆钙浓度的再次增高,仪器所监测到的真正的凝固曲线的部分则越来越少。因此出现了实验中的情况。

另外,本研究结果显示,随着血浆钙浓度增高,APTT逐渐降低,凝血因子激活期时间的降低有统计学意义,而纤维蛋白生成期时间变化无统计学意义。钙作为辅因子几乎参与了整个凝血过程。因此增加血浆钙浓度可明显缩短APTT以及凝血因子激活期时间[1,3-4],但是凝血酶催化纤维蛋白原变成纤维蛋白(因APTT检测不涉及因子)的过程即纤维蛋白生成期并没有钙参与[1,2],这可能是纤维蛋白生成期时间不随血浆钙浓度增高而明显缩短的原因。

钙作为辅因子几乎参与了整个凝血过程,样本中血浆钙的浓度极有可能影响APTT测定结果[3-4],本研究结果进一步证实了这一观点,这与Tu等[8]测定脑出血患者的钙浓度与其APTT相关性的研究结果相一致,

综上,血浆钙浓度对APTT时间及其曲线本身再到仪器报警信息均有较明显影响,尤其是当仪器报警不凝固时,如果按照APTT>170 s(仪器检测时间上限)的结果发布给临床医生时,临床医生可能会以相反的方向进行后续治疗,这将对患者的生命造成极大影响。因此,遇到上述情况时除考虑患者本身病理改变,还应重视对患者钙浓度的监控,以便及时调整抗凝剂比例以提高检验前质量控制,从而更好地服务于患者。