314例初次献血者Colton血型系统基因表型初步分析

李美霖,李琳琳,王 鹏,钟思程,张燕华

(北京市通州区 中心血站,北京101100)

Colton血型系统(CO,ISBT 015)包含一个高频等位基因和一个低频等位基因,分别表现为Coa和Cob抗原[1-2]。第三个抗原Co3存在于除缺失型Co(a-b-)之外所有的细胞上。Colton抗体多为免疫抗体,因输血或怀孕所诱发。抗-Coa抗体可导致严重的新生儿溶血病和迟发性溶血性输血反应。抗-Cob抗体常与其他血型抗体形成补体结合型抗Cob,引起速发性和迟发性溶血性输血反应[3-5]。本研究对314名初次献血者Colton血型系统进行基因表型检测,并对扩增产物进行测序。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源在2019年9月至2020年5月,随机选取本站采集的无血缘关系的314名初次献血者EDTA-K2 抗凝全血标本5 ml。

1.2 试剂与仪器基因组DNA 提取试剂盒(杭州博日,批号:20190601),人类红细胞血型Miltenburger,Diego,Colton,Yt(PCR-SSP法)(天津秀鹏,批号:191021001)。高速离心机(SIGMA1-14,美国SIGMA),涡旋混匀器(VDRTEX-5,其林贝尔),电泳仪和紫外分析仪(JY300C、JYO2S,北京君意东方),凝胶电泳槽(DYCP44P,北京六一),9700型PCR扩增仪(美国ABI)。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 按照DNA提取试剂盒说明书的方法提取DNA。DNA使用浓度为30～100 ng/μL之间,最佳质量浓度30～50 ng/μL,A260/280纯度比值1.6～1.8。

1.3.2PCR-SSP及测序 PCR-SSP及测序均按试剂盒说明书进行操作。Colton 血型基因型分型核苷酸突变点及引物序列见表1。内参质控为根据人类生长激素基因(HGH)的保守片段设计内参引物,存在于每个引物孔中,且在每次试验中运行。PCR扩增反应程序如下:96℃预变性2 min;96℃变性20 s,68℃ 60 s,5个循环;96℃20 s,65℃ 45 s,72℃ 30 s,10个循环;96℃ 20 s,62℃ 45 s,72℃ 30 s,15个循环;72℃延伸3 min,4℃保温。PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统下检测,记录结果。对纯化的扩增产物测序,与GenBank中的序列(ID:NG_007475.2)比对,分析结果。

表1 Colton 血型基因型分型核苷酸突变点及引物序列

1.3.3统计学分析 应用直接计数法计算基因频率,某基因频率=某基因的纯合子频率+1/2杂合子频率;基因型频率=AA基因型的个体数/该二倍体群体总数。采用χ2检验比较基因分布资料的观察值与期望值,以P<0.05为差异有统计学意义,分析是否符合Hardy-Weinberg平衡法则。

2 结果

2.1 314名初次献血者Colton血型系统基因分型及基因频率筛选出Coa+b+表型2例、Coa+b-表型312例,未发现其他表型。2例Coa+b+表型中1例为欧洲人、1例为维吾尔族,汉族中未发现Cob。χ2检验显示观察值与期望值差异无统计学意义(P>0.05),符合Hardy-Weinberg分布,见表2。

表2 初次献血者Colton血型系统基因分型及基因频率

2.2 Coa+b+表型测序结果对2例表型为Coa+b+的样本进行DNA 提取后,对编码AQP1基因的外显子1测序结果显示,134位碱基均发生杂合突变(134 C>C/T),见图1。

图1 1例Coa+b+基因测序的部分结果

3 讨论

Colton是一个相对简单的稀有血型系统,位于aquaporin-1(AQP1),AQP1是一种红细胞和肾细胞膜的结构蛋白,存在于肾、肺、血管内皮细胞、脑以及肝胆管、膀胱、眼。17kb的 AQP1基因包含4个外显子,原位杂交方法将其定位于染色体7p14。Colton血型的多态性来自外显子1上C134T的变化,是肽链第45位氨基酸不同所致,Coa及Cob为表现Ala45Val多样性的对偶抗原。Coa在各种族都是高频率抗原,白种人的分布频率为99.7%。Cob在白种人的分布频率为9.7%,在亚洲人群的频率很低,在菲律宾、泰国等均未发现有Cob存在的报道[6]。Co3的位置未知,有Coa或Cob即会有Co3,Co3的分布几乎为100%。

我国2008年开始建立中国人群稀有血型库,针对Duffy、Kell、Kidd、MNS、Gerbich、Diego、Yt、Lutheran、Colton、Ok 以及ABO,Rh 血型系统中高频抗原进行筛选[7]。截至目前Colton血型的报道很少,其中新疆维吾尔族Cob基因频率为0.005 9[8]、塔吉克族为0.04[9]、回族为0.006 8[10],西藏藏族为0.002 4[11],浙江汉族和畬族[12]、成都地区献血人群[13]等均未检出Cob。本次314名献血者中发现2例Cob+,均不是汉族。Cob频率为0.006 7,除去1例外籍献血者,Cob频率为0.003 3。Colton 血型系统基因频率可能因地域和民族存在差异,其他地区和民族的分布还有待进一步调查。

Colton 血型系统的检测因稀有血清较难获得,PCR 扩增技术则具有高灵敏度。每次实验设置内参引物作为质控,因其存在于所有人类的DNA样本中,PCR 扩增后在每个引物孔中稳定出现,可证明试验结果有效。本实验在PCR-SSP基因分型的基础上,采用直接测序法对Coa+b+进行基因测序,结果比较可靠。因北京地区献血者中外来人群占比较高,进一步扩大样本量继续对Colton 血型系统进行筛选,有助于了解我国各民族Colton 血型的分布特点,丰富中国红细胞稀有血型库。