安罗替尼对儿童T-急性淋巴细胞白血病细胞的抑制作用及机制研究

杨好好 岑梦姣 王佳萍

急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）由骨髓、血液和髓外部位淋巴祖细胞的恶性转化和增殖引起，70%的患者为儿童[1]。虽然化疗药物治疗儿童ALL 有一定疗效，但引起的药物不良反应不容忽视[2-4]。因此，寻找靶标明确、更为低毒有效的治疗药物对提高患者的生存质量具有重大意义。安罗替尼具有抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤生长的作用[5-6]，多种实体瘤的临床试验正在开展[7-8]。研究表明，安罗替尼通过抑制磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路降低B 细胞-ALL（B cell-ALL，BALL）细胞的活力[9]。然而，安罗替尼是否具有其他潜在的靶点仍待阐明。Abelson 酪氨酸蛋白激酶1（Abelson tyrosine kinase 1，ABL1）是一种酪氨酸激酶，由于染色体易位形成断点聚集区域（breakpoint cluster region，BCR）-ABL1 融合基因，部分BCR 基因和ABL1基因融合成一个新的BCR-ABL1 融合基因，导致产生异常的蛋白激酶BCR-ABL1[10]。研究发现，靶向PI3K/PKB/mTOR 信号通路的药物在ABL1 融合阳性的细胞中具有更好的抑制效果[11]。因此，ABL1 可能是治疗ALL 的潜在靶点。本研究通过细胞实验及生物信息学分析，探讨安罗替尼在儿童T 细胞-ALL（T cell-ALL，T-ALL）中的潜在作用，并分析其作用机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器 盐酸安罗替尼由正大天晴药业提供（规格：12 mg；批号：H20180004），儿童T-ALL 细胞CCRF-CEM 和J.gamma1（分别来源于3 岁11 个月和14岁患儿）购于浙江如耀生物科技有限公司，膜联蛋白V/碘化丙啶（annexin V/propidium iodide，Annexin V/PI）双染细胞凋亡检测试剂盒（批号：556547）购于美国BD公司，BCR-ABL1（批号：3009）、ABL1（批号：2862）、p-PKB（批号：4047）、PKB（批号：11848）、p-PI3K（批号：17366）、PI3K（批号：4255）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批号：5174），凋亡蛋白Caspase-3（批号：9662）、cl-Caspase-3（批号：9661）、cl-PARP（批号：5625）、Bax（批号：14796）、Bcl-2（批号：4223）抗体均购自美国CST 公司，细胞培养采用的RPMI1640 培养基（批号：BL303A）购于北京白鲨易公司，FBS（批号：10099141）、青霉素-链霉素（批号：15070063）均购于美国Gibco 公司，PKB激活剂SC79（305834-79-1）购于德国Merck 公司。倒置显微镜（型号：ECLIPSE Ti2）购于日本Nikon 公司，多功能酶标仪（型号：SpectraMax M）购于美国molecular devices 公司，化学发光成像系统（型号：ChemiDoc-It Imaging System）购于美国UVP 公司，流式细胞仪（型号：Attune）购于美国Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将CCRF-CEM 和J.gamma1细胞培养在含有10%FBS 的RPMI1640 培养基中，置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中。每2～3 d 取出，以800 r/min 离心3 min 后弃上清液，并以1∶2～1∶4 传代，培养至对数生长期后用于下一步实验。

1.2.2 细胞活性检测 收集处于对数增长期且生长状态良好的细胞，将细胞悬液按1×104个细胞/孔接种到96 孔板中，细胞培养箱孵育过夜。加入稀释好的不同浓度的安罗替尼，使终浓度为0、0.25、0.5、1、2.5、5、10、15 μmol/L，每个浓度设3 个复孔。细胞培养箱中孵育48 h 后，每孔加入20 μL 细胞计数套件-8（cell counting kit-8，CCK-8）溶液，继续培养4 h，用酶标仪检测450 nm 处的吸光度（OD）值，计算抑制率，抑制率（%）=（1-实验组OD 值/对照组OD 值）×100%，并计算半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.3 细胞凋亡检测 通过Annexin V/PI 双重染色，确定细胞凋亡水平。根据CCK-8 法测得的IC50，分别设置安罗替尼低、中、高浓度组（1.25、2.5 和5 μmol/L）及对照组（0 μmol/L），细胞经不同浓度处理24 h 后，800 r/min 离心5 min，弃上清液，将细胞悬浮在结合缓冲液中。加入5 μL Annexin V 和5 μL PI 溶液到细胞悬液中，室温避光孵育15 min。使用流式细胞仪检测细胞早期（细胞开始发生凋亡的初期阶段）和晚期（细胞凋亡的进一步发展阶段）的凋亡率。本实验重复3次。

1.2.4 药物靶标预测 通过Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得安罗替尼的简化分子线性输入规范（simplified molecular input line entry system，SMILE）号，而 后 利 用SEA（sea. bkslab. org/）、MolTarPred（moltarpred.marseille.inserm.fr/）和Swisstarget（swisstargetprediction.ch/index.php）等在线小分子靶标预测网站，对安罗替尼的作用靶标进行预测。从Genecard（https://www.genecards.org/）上获取与ALL 相关的基因。通过生物信息网站制作安罗替尼和ALL 的交集（http://www.bioinformatics.com.cn）。从PDB（rcsb.org/）上获取目标蛋白ABL1 的3D 结构（PDB ID：4wa9），利用Vina2进行安罗替尼与ABL1 蛋白结合的模拟对接。使用Pymol 软件将对接结果进行可视化。

1.2.5 京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 将安罗替尼潜在作用靶标列表导入DAVID 在线数据库（https://david.ncifcrf.gov），进行KEGG 通路富集分析。

1.2.6 凋亡蛋白表达水平检测 采用Western blot 法。收集经安罗替尼处理后的CCRF-CEM 和J.gamma1 细胞，在冰上加入RIPA 细胞裂解液裂解10 min，4 ℃下12 000 r/min，离心后取出上清液并用双硫键还原剂（bicinchoninic acid，BCA）法进行定量，加热煮沸使蛋白变性。经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺胶电泳分离总蛋白，随后转移到聚偏二氟乙烯膜上，室温下5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗于4 ℃孵育过夜，将膜用TBST 洗涤3 次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，再洗膜3 次，加入ECL 用化学发光成像系统成像。用Image J 对蛋白条带进行量化，以GADPH 为内参计算蛋白相对表达量。

1.2.7 ABL1/PI3K/PKB 信号通路蛋白检测 采用Western blot 法。收集经0、1.25、2.5、5 μmol/L 安罗替尼处理48 h 后的CCRF-CEM 和J.gamma1 细胞，检测不同浓度安罗替尼对BCR-ABL1 的影响。之后，根据安罗替尼对ABL1 的抑制作用，并可能抑制下游PI3K/PKB 通路，给予5 μmol/L SC79 进行回复实验，以验证该通路中的蛋白表达量变化。蛋白提取和检测方法同1.2.6。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0 统计软件，计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度安罗替尼对ALL 细胞增殖及形态的影响 在不同浓度安罗替尼作用下，CCRF-CEM 和J.gamma1 细胞的增殖受到抑制，且抑制率随浓度的增加而增加（F=317.6、342.1，均P＜0.05），见图1A。CCRFCEM 和J.gamma1 细胞在48 h 的IC50值分别为3.39、2.36 μmol/L。显微镜下显示，随着安罗替尼浓度的增加，细胞数量减少，轻微皱缩，推测存在细胞凋亡，见图1B。

图1 不同浓度安罗替尼对CCRF-CEM 和J.gamma1 细胞增殖及细胞形态的影响（A：不同浓度安罗替尼对CCRF-CEM 和J.gamma1细胞的抑制率；B：不同浓度安罗替尼作用下CCRF-CEM 和J.gamma1 细胞显微镜下所见，×100）

2.2 不同浓度安罗替尼对T-ALL 细胞凋亡的影响随着安罗替尼浓度的增加，ALL 细胞发生凋亡，凋亡率随着浓度的增加而增加，与对照组比较，高浓度组CCRF-CEM、J.gamma1 早期及晚期凋亡率均增加（均P＜0.01），见表1。细胞凋亡相关蛋白的表达水平显示，安罗替尼抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达，促进了凋亡促进蛋白Bax 和cl-PARP 的表达，提高了Caspase-3的活化，并呈现剂量依赖性，高浓度组cl-PARP 和Bax升高最为显著（P＜0.05），见图2。

表1 不同浓度安罗替尼作用下CCRF-CEM、J.gamma1 细胞的凋亡率比较

图2 不同浓度安罗替尼对凋亡相关蛋白表达的影响（A：CCRF-CEM 细胞中凋亡相关蛋白的电泳图；B：J.gamma1 细胞中凋亡相关蛋白的电泳图；C：CCRF-CEM 细胞免疫印迹量化结果；D：J.gamma1 细胞免疫印迹量化结果；与对照组比较，aP＜0.05）

2.3 安罗替尼靶标分析以及与ABL1 分子对接结果KEGG 通路富集得到13 条信号通路，见图3A（插页），主要涉及Ras、Rap1、PI3K-PKB、NF-κB 信号，造血细胞系，癌症的碳代谢，表明安罗替尼可能作用于这些信号通路抑制细胞增殖。通过多个靶标预测网站的结果得到交集为ABL1 见图3B（插页），分子对接显示安罗替尼与ABL1 的潜在结合能为-8.8 kcal/mol 见图3C（插页），与氨基酸残基Met318 之间产生氢键，与氨基酸残基Leu248、Leu370、Phe382、Ala269、Lys271、Val256、Ala380 之间存在疏水相互作用，表明安罗替尼与ABL1 结合能较强。

图3 安罗替尼靶标分析以及其与ABL1 分子对接结果图（A：KEGG 富集得到13 条通路，Y 轴代表路径的名称，X 轴表示靶向的基因背景的基因的比例，点的大小表示该通路中包含的基因与输入基因列表交集的基因数；B：不同网站对安罗替尼靶点预测的韦恩图；C：安罗替尼与ABL1 分子对接示意图）

2.4 不同浓度安罗替尼对ABL1/PI3K/PKB 蛋白表达和细胞活性的影响 安罗替尼作用于CCRF-CEM 和J.gamma1 细胞后，BCR-ABL1 的表达均降低（均P＜0.05）。加入SC79 后，两种细胞内p-PKB/PKB 表达均升高（均P＜0.05），逆转了安罗替尼对ABL1/PI3K/PKB通路的抑制效果，见图4。

图4 不同浓度安罗替尼对ABL1/PI3K/PKB 蛋白表达和细胞活性影响（A：不同浓度安罗替尼对BCR-ABL1 蛋白表达的电泳图及量化结果；B：加入SC79 后，安罗替尼对BCR-ABL1/PI3K/PKB 表达的电泳图及量化结果；与对照组比较，aP＜0.05；与SC79 组相比，bP＜0.05）

3 讨论

T-ALL 会导致患者造血功能受损和骨髓衰竭[12-13]。临床上治疗手段有限，仍以化疗（如甲氨蝶呤、糖皮质激素、长春新碱等）或者骨髓移植为主，但药物治疗往往伴随着较大的不良反应[3,14]，且易出现耐药[15-16]。因此，开发新的T-ALL 治疗药物迫在眉睫。安罗替尼是国内自主研发的酪氨酸激酶抑制剂，在多种实体瘤中具有抗肿瘤作用[17-18]，但是对于血液肿瘤的应用鲜有报道。最新的研究表明，安罗替尼通过抑制PI3K/PKB/mTOR 途径诱导B-ALL 细胞的凋亡，引起G2/M 周期的停滞[9]，这为安罗替尼治疗ALL 提供了重要的研究基础。为探讨安罗替尼对T-ALL 抑制效果，本研究发现，安罗替尼对T-ALL 细胞株J.gamma1 有更好的抑制作用，高浓度能显著抑制T-ALL 细胞增殖，并导致细胞皱缩。进一步研究发现，安罗替尼可剂量依赖性促进Caspase-3 的活化以及促凋亡相关蛋白，如Bax 和cl-PARP 等表达，最终引起T-ALL 细胞凋亡，与在其他实体瘤中的研究结果一致[19-20]。

通过生物信息学方法预测安罗替尼靶标结果表明，主要靶标可能涉及Ras、Rap1、PI3K-PKB、NF-κB等信号通路，造血细胞系，癌症的中枢碳代谢，表明安罗替尼可能作用于这些信号通路抑制肿瘤的进展。但以上预测结果的具体机制仍有待研究验证。进一步的分子对接结果显示，BCR-ABL1 是安罗替尼治疗ALL 的潜在靶标，BCR-ABL1 是肿瘤治疗重要靶点[21]。ABL1 活化后可进一步激活PI3K/PKB，而PI3K/PKB/mTOR 信号通路在BCR-ABL1 阳性ALL 患者中被显著激活[22]，通过抑制BCR-ABL1 能够诱导ALL 细胞的凋亡，抑制细胞活性。给予PKB 激活剂后显著削弱安罗替尼诱导的ALL 细胞凋亡，这些结果均证实，安罗替尼通过抑制BCR-ABL1/PI3K/PKB 信号通路抑制CCRFCEM 和J.gamma1 细胞的增殖。临床上，甲磺酸伊马替尼特异性靶向BCR-ABL1 融合基因，不仅广泛用于慢性粒细胞白血病的治疗[23]，而且也使T-ALL 患者获得持久的血液学缓解[24]，提示靶向抑制BCR-ABL1 也有望在T-ALL患者中获益。

综上所述，安罗替尼可能通过BCR-ABL1/PI3K/PKB 信号通路发挥抗ALL 作用，并可诱导细胞凋亡。本研究也为安罗替尼治疗BCR-ABL1 阳性的ALL 患者提供了重要的研究基础，后续将重点考察安罗替尼在T-ALL 动物模型中的应用，并探讨最佳的给药剂量。