PCR-荧光探针法和核酸序列测定法对呼吸道病原体的检测效能比较及呼吸道病原体的流行特征分析

杨文杰 王晓明 童文娟 董学妍 戴卫健 林源吉 王贤军 余道军

人类呼吸道感染主要是由病毒引起，通过气溶胶或接触发生传播[1]，常见的呼吸道病毒包括流感病毒（influenza virus，IFV）、人冠状病毒（human coronavirus，HCOV）、人鼻病毒（human rhinovirus，HRV）、人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV）和人腺病毒（human adenovirus，HADV）等。呼吸道病毒可单一感染，也可出现混合感染，这些病毒引起的呼吸道感染临床表现相似，病毒类型常常难以区分[2-3]。呼吸道病毒的检测，目前国内外多采用病毒的分离培养与鉴定、核酸序列测定法、免疫学检测以及分子生物学检测法[4]。临床上对病毒快速检测的迫切需求使得分子生物学技术得以广泛应用[5]，如PCR-荧光探针法（荧光定量PCR 法）和核酸序列测定法（Sanger 测序法）等，这些检测方法或周转时间更短，或灵敏度更高。本文采用PCR-荧光探针法和核酸序列测定法检测呼吸道病原体，对比分析两种方法的检测效能，为基于荧光定量PCR 方法检测呼吸道病原体分子诊断试剂研发提供临床验证数据；进一步分析呼吸道感染患者呼吸道病原体的流行特征，为临床分析判断呼吸道病原体流行状况及诊治提供帮助，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2019 年7 至12 月浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院呼吸道感染患者309 例，其中男159 例，女150 例，年龄4.00（3.00，7.00）岁。根据年龄不同分为：＜6 岁组198 例（64.08%），6～21 岁组71 例（22.98%），22～59 岁组29 例（9.39%），≥60 岁组11 例（3.55%）。入选标准：临床诊断为呼吸道感染的病例[如甲型流感病毒（influenza A virus, IAV）、乙型流感病毒（influenza B virus，IBV）、人副流感病毒Ⅰ（human parainfluenza virus type Ⅰ，HPIV Ⅰ）型、人副流感病毒Ⅱ（human parainfluenza virus type Ⅱ，HPIV Ⅱ）型、人副流感病毒Ⅲ（human parainfluenza virus type Ⅲ，HPIVⅢ）型、HADV、HRSV、人冠状病毒229E（human coronavirus 229E，HCOV-229E）、人冠状病毒OC43（human coronavirus OC43，HCOV-OC43）、人 冠 状 病 毒NL63（human coronavirus NL63，HCOV-NL63）、人冠状病毒HKU1（human coronavirus HKU1，HCOV-HKU1）、人博卡病毒（human bocavirus，HBOV）、人偏肺病毒（human metapneumovirus，HMPV）、HRV、风疹病毒（rubella virus，RV）、麻疹病毒（measles virus，MeV）、腮 腺炎病毒（mumps virus，MuV）、肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）及 肺 炎 衣 原 体（chlamydia pneumoniae，CP），共17 个型别的呼吸道病毒和2 种非典型性肺炎病原体]；样本为临床诊疗常规检测后剩余样本，样本余量不少于500 μL；样本信息完整、可溯源，包含年龄、性别、病例编号、采样日期、临床诊断等。排除标准：样本量不足以检测者；样本信息不明确；因人为因素（操作过程样本污染）或仪器问题导致无法完成实验过程的样本；实验测定结果只有PCR-荧光探针法或核酸序列测定法的检测结果。

1.2 实验材料和仪器 人呼吸道病原体核酸联合检测试剂盒（批号：2019030011，厦门安普利生物工程有限公司生产），核酸提取试剂盒（闽厦械备20170006，厦门安普利生产），实时荧光定量PCR 仪（型号：7500，注册证号：国械注进20163220767，美国ABI 公司生产），ABI3730XL 测序仪[通用生物系统（安徽）有限公司生产]。

1.3 方法

1.3.1 标本采集方法 从口腔取样时，棉拭子在口腔拱形上颚的后方擦拭；从鼻腔取样时，棉拭子插入鼻孔内至鼻腭处，稍加压力旋转采集，用相同方法擦拭另一侧鼻孔；将采集标本后的棉拭子浸入预加1 mL 标本保存液的离心管中充分洗脱，将棉拭子充分挤干后丢弃，检测前振摇标本管，使之充分混匀备用。待测分泌物拭子在2～8 ℃保存，保存期不超过72 h；实验采用的样本类型为鼻咽拭子或咽拭子，为临床诊疗过程中正常采集样本的剩余样本。本研究经本院医学伦理委员会审查通过[批准文号：2019 医伦审第（011）号-1]，免于受试者的知情同意。

1.3.2 标本设盲编号 标本入组完成后，设盲人员将标本充分混匀分装成两管（一管用于试验用体外诊断试剂PCR-荧光探针法检测（不少于200 μL），另一管用于核酸序列测定法检测（不少于300 μL），同时按照设盲表填写设盲记录，设盲表为随机软件生成，在每份标本管上标记设盲号，而不标记样本编号，设盲后将设盲表封存，由盲态试验人员进行检测，在两种方法检测完毕后揭盲，将检测结果填写在临床试验结果记录表上。

1.3.3 试验方法 （1）PCR-荧光探针法：收集样本分装、随机编号、设盲后，按照试剂盒说明书进行操作，可检测出19 个型别的呼吸道病原体。（2）核酸序列测定法：采用Sanger 法测序进行操作。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0 统计软件。计数资料以百分率表示。以核酸序列测定结果为金标准，对PCR-荧光探针法的检测结果进行统计分析，分析PCR-荧光探针法检测不同病原体的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值[5]。

2 结果

2.1 PCR-荧光探针法检测各病原体的结果 对309例标本进行PCR-荧光探针法和核酸序列测定法检测，PCR-荧光探针法对各病原体的检测灵敏度均为100.00%，特异度为99.65%～100.00%，阳性预测值为75.00%～100.00%，阴性预测值均为100.00%，见表1。两种方法检测结果不一致或不完全一致的样本共2 例（其中1 例PCR-荧光探针法检测MP 阳性，但核酸序列测定法检测为阴性，另1 例荧光PCR-荧光探针法检测结果为HADV、HRSV 同时阳性，但核酸序列测定法结果仅HADV 阳性）。

表1 PCR-荧光探针法检测各病原体的结果

2.2 两种方法检测各病原体的阳性结果 两种方法检测各病原体的阳性结果比较见表2，两种方法检测HCOV 和HPIV 各亚型的阳性结果比较见表3、表4。

表2 两种方法检测各病原体的阳性结果比较[例（%）]

表3 两种方法检测HCOV 各亚型的阳性结果比较[例（%）]

表4 两种方法检测HPIV 各亚型的阳性结果比较[例（%）]

2.3 不同年龄组的病原体分布情况 ＜6 岁组和6～21 岁组检测出18 种呼吸道病原体，其中以HRV 检出率最高，其次是HADV 和MP；22～59 岁组共检出9 种呼吸道病原体，其中以HRV 检出率最高；≥60 岁组共检出8 种呼吸道病原体，以HBOV 为主。见表5。

表5 不同年龄组的病原体分布情况[例（%）]

3 讨论

临床上，造成呼吸道感染的病原体主要涉及病毒、细菌和真菌，其中病毒的占比最高[7]。呼吸道病毒感染常为细菌定植提供条件，常常引起细菌和病毒混合感染[8]，其临床感染症状和流行特点相似，仅靠临床表现难以鉴别，而准确快速的病原学诊断对于临床制定治疗方案和控制传染病的流行具有重要意义。

目前呼吸道感染病原体的实验室诊断有多种方法，痰细菌培养仍是常规检测方法，但对于其他如病毒、非典型病原体等，培养耗时长，技术要求非常高，仅适用于实验室研究；血清学方法技术成熟，有商品试剂盒供应，灵敏度和特异度都已明确，缺点是需要检测急性期和恢复期双份血清才有诊断意义，在临床实际应用中受到限制；多重荧光定量PCR 检测法可准确快速同时检测呼吸道感染多种病原体，且取材方便，不受抗生素影响，简单实用，经济方便[9-10]。鉴于此，本研究使用了可同时检测多种呼吸道病原体的多重荧光PCR 试剂盒（PCR-荧光探针法），对309 例患者的临床样本进行病原体核酸检测，以核酸序列测定法为金标准，分析PCR-荧光探针法对不同病原体检测的灵敏度和特异度，结果表明PCR-荧光探针法的检测灵敏度均为100.00%，特异度为99.65%～100.00%，两种方法的检测结果不一致或不完全一致的样本仅2 例，说明两种方法的检测结果具有高度一致性。核酸序列测定法是基因检测的金标准[11]，具有准确度好且特异度高的优点，但其检测时间长、成本高等问题，不利于临床大面积推广及应用[12]。在本研究中，核酸序列测定法和PCR-荧光探针法的检测结果出现2 例不完全一致，可能是PCR-荧光探针法检测灵敏度较核酸序列测定法高，导致低浓度样本PCR-荧光探针法检测结果为阳性而核酸序列测定法检测结果为阴性。相较于核酸序列测定法，PCR-荧光探针法特异度强、灵敏度高、检测周期短，而且操作简便快捷，对操作人员技术要求相对较低，使用仪器设备简单，检测费用相对低廉，能够实现绝对定量。因此，PCR-荧光探针法能够快速检测病原体，为临床的早期诊断和治疗提供了更大的可能性[13]。

在确定PCR-荧光探针法试剂的可靠检测性能后，本研究对309 例呼吸道感染患者的病原体分布特征进行了分析，研究发现：学龄前（＜6 岁）和6～21 岁呼吸道感染患者检测出多达18 种病原体，22～59 岁和60 岁及以上呼吸道感染患者病原体检出种类相对较少（分别检出9 种和8 种），但儿童和22～59 岁呼吸道感染患者病原体检出率最高的都是HRV，而60 岁及以上呼吸道感染患者以HBOV 为主。研究结果表明，儿童及中青年呼吸道感染病原体分布广泛，种类众多，但以HRV 为主。HRV 广泛存在，很容易在学校和办公场所等人群聚集的地方扩散，毒力相对较弱[14]，儿童及中青年人群社会活动范围较大，交流频繁，极易导致交叉感染，故而导致儿童及中青年感染HRV 较多；60岁及以上患者却以HBOV 为主，可能与这类人群以居家为主，外出活动较少，而HBOV 可在人和动物之间传播[15]，老年人因居家时间较长，与宠物接触相对较多[16]，故而导致60 岁及以上患者以HBOV 为主。不过，本研究中60 岁及以上患者较少，只有3 例HBOV 阳性，这也可能是与其他文献报道不一致的原因。另外，本研究结果显示呼吸道混合感染以两种病原体共感染为主，儿童以HRV 与其他病毒混合感染最为常见，而60 岁及以上患者以HBOV 与其他病原体混合感染为主。

鉴于HPIV 和HCOV 亚型较多，各亚型的流行特征和致病力各有不同，因此，本研究对HCOV 和HPIV 的各亚型检出率进行了统计分析。HPIV 各亚型中检出率从高到低分别为HPIVⅡ型、HPIVⅠ型和HPIVⅢ型，其中HPIVⅡ型检出率是HPIV Ⅲ型的2 倍，表明本研究人群HPIV 感染以Ⅱ型为主，这与国内文献报道一致[17-18]。另外，本研究对主要的冠状病毒亚型进行了统计分析，发现β-冠状病毒HCOV-OC43 的检出率最高，其次是α-冠状病毒HCOV-229E，表明HCOV 感染以HCOV-OC43 为主。HCOV-OC43 感染后，主要表现为上呼吸道感染，一般情况下症状不严重，但HCOVOC43 对免疫力低下患者具有神经侵袭性，可能导致致命性脑炎[19-20]。因此，应密切监控HCOV-OC43 流行趋势，一旦检测到HCOV-OC43 感染，应引起足够重视，以防病情演变。

综上所述，本研究通过两种方法同时检测鼻咽拭子中的呼吸道病原体，结果表明PCR-荧光探针法更简便、灵敏、准确、安全，具有较高的临床应用价值。呼吸道感染病原体主要是鼻病毒，混合感染也比较常见，主要是以两种病原体混合感染为主，对HPIV 和HCOV 的分型检测临床意义明显。