2 型糖尿病合并下肢动脉粥样硬化性病变患者血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1的表达及其临床意义

王葳 李征寒 徐滨华 李姗姗 王晶 王立平 崔海波 赵艳宁

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是引起下肢动脉粥样硬化性病变（lower extremity atherosclerotic disease，LEAD）的重要原因之一[1]。与非糖尿病患者相比，T2DM 更易累及胫前动脉和股深动脉等中小动脉，LEAD 风险较非糖尿病患者增加2～4 倍，是T2DM 患者残疾和死亡的主要原因[2-3]。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是T2DM 合并LEAD 的根本原因，涉及血管内皮细胞的炎症反应和氧化应激[4-5]。新蝶呤是机体内蝶呤合成途径中一种中间代谢产物，能反映机体细胞免疫活化和炎症反应状态，血清新蝶呤升高与急性冠脉综合征患者冠状动脉病变程度有关[6-7]。豆荚蛋白是免疫信号转导中的重要因子，能通过蛋白水解激活先天免疫系统的Toll 样受体，诱导促炎细胞因子产生[8]。近期研究发现豆荚蛋白在颈AS斑块中表达上调，可能成为AS 的生物标志物[9]。Wnt1-诱导的信号通路蛋白1（Wnt1-induced signaling pathway protein 1，WISP1）是脂肪细胞分泌的一种脂肪因子，与代谢紊乱和胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）有关，同时Wnt 信号通路参与AS 发生、发展，且研究发现血清WISP1 水平是冠心病的独立预测因子[10-12]。然而到目前为止，关于血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平与T2DM 合并LEAD 的关系仍不明确。基于此，本研究分析了T2DM 合并LEAD 患者血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平与炎症反应指标、糖代谢及脂代谢指标的关系，并探讨3 者预测T2DM 合并LEAD 的价值，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2021 年1 月至2022 年1 月哈尔滨市第一医院收治的T2DM 患者114 例为T2DM 组，其中男60 例，女54 例；年龄34～84（62.25±10.47）岁；BMI 17～26（21.96±2.15）kg/m2；T2DM 病 程5.00（3.00，9.25）年。另择同期在本院进行体检的健康志愿者52名为对照组，其中男28 名，女24 名；年龄32～81（61.51±8.65）岁；BMI 18～26（22.05±1.68）kg/m2。两组对象性别、年龄、BMI 等一般资料比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。T2DM 组纳入标准：符合《中国2型糖尿病防治指南（2017 年版）》T2DM 的诊断标准[13]；临床资料完整。排除标准：1 型糖尿病、妊娠期糖尿病等其他类型糖尿病，合并感染性疾病、冠心病或脑卒中，有高血压史、脑卒中史、高脂血症史，合并严重肝肾功能损害、造血和免疫系统损害、恶性肿瘤者。本研究经本院医学伦理委员会审查通过（批准文号：202012261），患者及家属均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 患者一般资料收集 收集T2DM 组患者T2DM病程、吸烟情况，使用日本欧姆龙HEM-7200 电子血压计测量患者入院时的收缩压和舒张压。

1.2.2 生化指标检测 采集T2DM 组患者入院后次日清晨和对照组体检时6 mL 外周静脉血，收集血清。（1）炎症反应指标：采用粒子增强免疫比浊法测定CRP 水平，采用ELISA 法测定IL-6 水平。（2）糖代谢指标：采用美国贝克曼库尔特公司AU5800 全自动生化分析仪检测FBG，采用放射免疫法测定空腹胰岛素（fasting insulin，FINS），采用高效液相色谱法测定糖化血红蛋白（glycated hemoglobin A1C，HbA1C），并根据稳态模型评估（homeostasis model assessment，HOMA）计算HOMAIR＝FBG（mmol/L）×FINS（μU/mL）/22.5。（3）脂代谢指标：采用美国贝克曼库尔特公司AU5800 全自动生化分析仪检测TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平。（4）其他相关指标检测：采用美国贝克曼库尔特公司AU5800 全自动生化分析仪检测血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿酸（uric acid，UA）、ALT、AST 水平，采用ELISA 法测定新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平。试剂盒均购自上海梵态生物科技有限公司，批内和批间变异系数分别＜10%和＜15%。

1.2.3 踝肱指数测量 所有T2DM 患者入院后均测量踝肱指数，患者取仰卧位，采用法国声科影像公司生产的MACH 40 超声多普勒血流探测仪测定踝部动脉收缩压和同侧肱动脉收缩压，两者比值即为踝肱指数。参考《中国2 型糖尿病防治指南（2017 年版）》将静息踝肱指数≤0.90 的患者诊断为LEAD，或运动时下肢不适，静息踝肱指数≥0.90，但踏车平板试验后踝肱指数下降15%～20%也诊断为LEAD[13]。根据是否合并LEAD 将T2DM 组患者分为LEAD 亚组和非LEAD 亚组。

1.3 统计学处理 采用SPSS 28.0 统计软件。正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用U检验。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。Pearson 相关或Spearman 秩相关分析血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平与炎症反应、糖代谢及脂代谢指标的相关性；多因素logistic 回归分析T2DM 合并LEAD 的危险因素；ROC 曲线分析血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平单独与联合预测T2DM 合并LEAD 的效能。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组对象血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平比较 T2DM 组血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平均高于对照组（均P＜0.01），见表1。

表1 两组对象血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平比较

2.2 两亚组患者一般资料和血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平比较 LEAD 亚组T2DM 病程长于非LEAD亚组，年龄、吸烟比例和CRP、IL-6、LDL-C、FBG、HbA1C、HOMA-IR、新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平均高于非LEAD 亚组（均P＜0.05），余指标差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 两亚组患者一般资料和血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平比较

2.3 血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平与炎症反应、糖代谢及脂代谢指标的相关性分析 血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平与CRP、IL-6、LDL-C、FBG、HbA1C和HOMA-IR 均呈正相关（均P＜0.05）；与TC、TG、HDL-C、FINS 均无关（均P＞0.05）。见表3。

表3 血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平与炎症反应、糖代谢及脂代谢指标的相关性

2.4 T2DM 合并LEAD 的多因素logistic 回归分析 以年龄、T2DM 病程、吸烟（有=1，无=0）、CRP、IL-6、LDLC、FBG、HbA1C、HOMA-IR、新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1为自变量，建立多因素logistic 回归模型。结果显示，年龄、T2DM 病程、吸烟、CRP、IL-6、LDL-C、HbA1C、HOMA-IR、新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 均为T2DM 合并LEAD 的危险因素（均P＜0.05），见表4。

表4 T2DM 合并LEAD 的多因素logistic 回归分析

2.5 血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 单独与联合检测对T2DM 合并LEAD 的预测效能 ROC 曲线显示，血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 联合检测预测T2DM 合并LEAD 的AUC 大于新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 单独检测预测（Z=4.115、3.540、3.633，均P＜0.01），见表5、图1。

表5 血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 单独与联合检测对T2DM合并LEAD 的预测效能分析

图1 血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平单独与联合预测T2DM 合 并LEAD 的ROC 曲线

3 讨论

T2DM 合并LEAD 具有病变广泛的特点，不仅存在中、大动脉病变，更多的涉及膝下中、小动脉，以血管中膜钙化、节段性狭窄或闭塞为主要表现，是糖尿病足溃疡发生的最重要机制，也是T2DM 患者致残的主要原因之一[14]。数据显示，我国＞50 岁T2DM 患者LEAD 发生率为21.2%，LEAD 导致的足溃疡复发率和截肢率较糖尿病神经病变导致的足溃疡更高[15]。同时作为全身动脉病变的局部表现，LEAD 的存在还会增加心血管事件发生率，LEAD 确诊1 年后心血管事件发生率为21.1%，是导致患者死亡的主要原因[16]。由于T2DM 合并LEAD 具备自身病理和解剖的特点，易合并糖尿病神经病变，可掩盖疼痛，待出现间歇性跛行、动脉搏动减弱时已是LEAD 的中晚期，因此早期发现LEAD 并积极给予治疗，对阻止或延迟截肢的发生和预防心血管事件具有重要意义。

AS 是LEAD 发生的根本病因，而血管内皮功能障碍是AS 发生的始动因素，其中炎症贯穿AS 发生、发展的整个过程，糖尿病高血糖状态下糖化蛋白质和核酸等大分子形成晚期糖基化终末产物，增加内皮细胞中促炎细胞释放，直接损害内皮促进AS[4]。新蝶呤是单核来源的巨噬细胞在IFN-γ 的作用下活化时合成和释放的一种炎症因子，由于IFN-γ 的释放与Th 的活化呈因果关系，因此新蝶呤的产生与免疫细胞的活化直接相关[17]。巨噬细胞的活化参与新蝶呤合成和释放，同时作为炎性因子的主要来源，巨噬细胞释放的炎症因子能参与血管内皮功能障碍，促炎型和抗炎型巨噬细胞的不平衡影响AS 斑块稳定性[18]。本研究结果显示，T2DM 患者血清新蝶呤水平升高，分析可能与T2DM 引起免疫细胞活化导致新蝶呤大量表达有关。进一步分析发现，T2DM 合并LEAD 患者血清新蝶呤水平进一步升高，是T2DM 合并LEAD 的危险因素，说明新蝶呤与T2DM 合并LEAD 密切相关，分析其可能的原因是新蝶呤作为免疫细胞活化的标志，高水平新蝶呤反映炎性因子大量释放参与AS 进展，最终引起LEAD。本研究结果也显示，血清新蝶呤与CRP 和IL-6 水平呈正相关，进一步证实了这一点。

豆荚蛋白是半胱氨酸蛋白酶家族一员，巨噬细胞中表达最高，在巨噬细胞活化时释放以诱导单核细胞迁移和聚集，增强炎症反应[8]。动物实验发现，豆荚蛋白mRNA 表达随着小鼠主动脉粥样硬化发展而增加，与AS 病变中巨噬细胞释放的炎症细胞积累增加有关[19]。同时试验指出，AS 患者血浆和斑块中豆荚蛋白水平升高[9]。本研究结果显示，T2DM 患者血清豆荚蛋白水平升高，分析可能与T2DM 患者高血糖诱导巨噬细胞活化引起豆荚蛋白大量表达有关。进一步分析发现，T2DM 合并LEAD 患者血清豆荚蛋白水平进一步升高，是T2DM 合并LEAD 的危险因素，说明豆荚蛋白与T2DM 合并LEAD 密切相关，与豆荚蛋白大量表达反映巨噬细胞大量活化，释放炎症细胞因子参与AS 有关。Ozawa 等[20]研究指出，豆荚蛋白基因表达受促炎细胞因子表达调节，豆荚蛋白能增强促炎型巨噬细胞表型发展和诱导LDL 氧化，促进AS 发生、发展。本研究结果也显示，T2DM 合并LEAD 患者血清豆荚蛋白与CRP 和IL-6 水平呈正相关，说明豆荚蛋白可能通过炎症反应参与LEAD 发生。

WISP1 作为一种新型的炎症相关脂肪因子，在机体慢性炎症导致的肥胖、IR 和AS 中发挥重要作用[21]。实验显示，循环中WISP1 表达受肥胖调节，在高脂喂养的小鼠循环中WISP1 水平升高，并能通过Toll 样受体激活炎症因子促进IR[22]。血管平滑肌细胞迁移和增殖是AS 过程中的重要一环，在培养的大鼠血管平滑肌细胞中，WISP1 以剂量依赖性方式刺激血管平滑肌细胞的迁移和增殖[23]。这些研究提示，WISP1 可能与糖尿病患者AS 有关。本研究结果显示，T2DM 患者血清WISP1 水平升高，分析可能与T2DM 患者高血糖引起脂肪代谢紊乱诱导WISP1 大量表达有关。进一步分析发现，WISP1 水平升高是T2DM 合并LEAD 的危险因素，说明WISP1 与T2DM 合并LEAD 密切相关，可能与WISP1 能引起巨噬细胞大量活化，释放炎症因子参与AS 有关。研究表明，人类脂肪组织中WISP1 mRNA 表达与巨噬细胞浸润呈正相关，体外培养的巨噬细胞被WISP1 刺激后能增加IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α 等促炎细胞因子表达[24]。本研究结果也显示，血清WISP1 与CRP 和IL-6 水平呈正相关，与上述研究结论相符。

糖脂代谢紊乱是AS 的促进因素，也是T2DM 合并LEAD 的病理特点，其中LDL-C 在血管内皮细胞下的聚集是AS 发生的必要条件，降低LDL-C 水平能显著降低T2DM 患者合并LEAD 的风险[25-26]。本研究中LDL-C、HbA1C、HOMA-IR 均为T2DM 合并LEAD 的独立危险因素，说明糖脂代谢紊乱与T2DM 合并LEAD 独立相关。同时结果显示，血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平与LDL-C、FBG、HbA1C、HOMA-IR 均呈正相关，说明新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平升高可能通过糖脂代谢紊乱参与LEAD 发生，糖脂代谢紊乱均能诱发炎症，而炎症也能促进脂代谢紊乱和IR。研究表明，炎症能促进细胞对脂质的摄取和蓄积导致脂代谢紊乱，同时也能通过干扰、损害胰岛素信号通路的信号传导导致IR[27-28]。本研究中FBG 并非T2DM 合并LEAD 的独立危险因素，考虑与FBG 影响因素较多有关。与既往报道相似，本研究中年龄和吸烟也与T2DM 合并LEAD 相关[14]。T2DM 患者随着年龄增大，血管壁硬化指数越高，同时年龄越大T2DM 病程越长，合并吸烟、高血脂等危险因素越多，因此更容易发生LEAD。香烟中尼古丁能损伤动脉血管壁，并增加循环中LDL 的氧化修饰，同时影响凝血和纤溶系统导致AS[29-30]。本研究ROC 曲线分析结果表明，血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平对T2DM 合并LEAD 均具有一定的预测效能，且联合检测能提升对T2DM 合并LEAD 的预测效能，更好地指导临床。

综上所述，血清新蝶呤、豆荚蛋白、WISP1 水平的升高与T2DM 合并LEAD 存在相关性，可作为T2DM 合并LEAD 的辅助预测指标，但本研究为单中心小样本研究，可能存在选择偏倚，还需多中心大样本研究来证实，同时多数入选的T2DM 患者并非新发患者，不能排除降糖药物和胰岛素等因素的影响，在今后的研究中应对上述不足予以改进。