HOXA10基因敲低对非小细胞肺癌安罗替尼敏感性的影响

李俞羲，路遥，田野

（中国医科大学附属第四医院 1.麻醉科；2.胸外科，沈阳 110032）

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤［1］，严重威胁人类健康。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的最常见类型，约占确诊肺癌的80%～85%［1］。目前，NSCLC的治疗手段主要包括外科手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗。尽管近年来NSCLC的治疗方法不断进步，但是由于多数NSCLC患者确诊时已属临床Ⅳ期，无法采用外科手术切除，而以铂类为基础的化疗存在耐药性［2］。目前NSCLC患者的5年生存率仅为10%～15%［1］，因此寻找更有效的临床治疗方法对提高患者生存率十分重要。

安罗替尼是小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，能够有效抑制血管内皮生长因子受体、血小板源生长因子受体和成纤维生长因子受体等［3］。临床研究［4-5］表明，安罗替尼作为三线药物可以显著延长NSCLC患者的总生存期和无进展生存期。RNA高通量测序和分析发现同源异型盒基因A10（homeobox A10，HOXA10）与NSCLC对安罗替尼的耐药性相关［6］，然而具体的作用机制尚未阐明。研究抗肿瘤药物的耐药机制有利于改善治疗效果，进一步优化治疗方案。因此，本研究通过敲低HOXA10，探讨HOXA10对NSCLC细胞安罗替尼敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚肺成纤维细胞MRC-5、人肺癌细胞A549和PC-9购自中国科学院上海细胞库。安罗替尼购自美国MCE公司。DMEM培养基、胎牛血清、HOXA10小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、对照siRNA和Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Thermo Fisher公司。CCK-8试剂、Annexin V凋亡检测试剂盒购自碧云天公司。HOXA10、GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司。Transwell小室购自美国康宁公司。

1.2 细胞培养和转染

人肺癌细胞A549和PC-9培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基内，培养液内含有青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL。细胞均置于含5% CO2的37℃培养箱内培养，0.25%胰酶-EDTA消化传代，细胞处于对数生长期时用于实验。当细胞生长融合度为70%～80%时，按照Lipofectamine 2000试剂说明书转染si-NC（对照组）或si-HOXA10。

1.3 RNA提取和实时定量PCR

采用TRIzol提取细胞总RNA，用QuantiTect Reverse Transcription 试剂盒反转录为cDNA，随后使用SYBR Green PCR Master Mix进行实时定量PCR。引物序列：HOXA10，正向5’-CTCGCCCATAGACCTGTGG-3’，反向5’-GTTCTGCGCGAAAGAGCAC-3’；GAPDH，正 向5’-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’，反向5’-ACA CCATGTATTCCGGGTCAAT-3’。采用2-ΔΔCt法计算目的基因表达。

1.4 蛋白提取和Western blotting

采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取各样本等量蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转将蛋白转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，分别孵育HOXA10（1 ∶500）或者GAPDH（1 ∶1 000）一抗4 ℃过夜。洗膜后，室温孵育耦联HRP的二抗1 h。采用ECL发光液检测蛋白条带，GAPDH为内参。

1.5 CCK-8法

采用CCK-8法检测细胞增殖活性，以评估安罗替尼细胞毒性。将转染后的A549和PC-9细胞接种于96孔培养板中，以不同浓度（1、2、4、8、10、15、25、50、95 μg/mL）安罗替尼处理细胞。安罗替尼处理24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育1 h。酶标仪检测450 nm吸光度。每组设置至少3个复孔。

1.6 克隆形成实验

A549和PC-9细胞转染24 h后，以0.25%胰酶-EDTA消化，用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬并接种至6孔板，细胞密度为800/孔。继续培养14 d，4%多聚甲醛固定后进行0.1%结晶紫染色，拍照记录克隆数。

1.7 Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力

细胞迁移实验不需预包被Transwell小室，细胞侵袭实验前需用Matrigel包被Transwell小室。将转染后的A549和PC-9细胞悬液加入Transwell上室无血清培养，Transwell下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养液。Transwell上室和下室中均含4 μg/mL安罗替尼，细胞在含5% CO2的37℃培养箱内培养48 h，用棉签擦去Transwell上室细胞。4%多聚甲醛固定后以0.1%结晶紫染色。随机选取5个视野，计数每个视野中的迁移或侵袭细胞数。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡

采用Annexin V/碘化丙啶染色，经流式细胞术检测细胞凋亡率。转染后的细胞用8 μg/mL安罗替尼处理24 h。细胞以胰酶消化，用PBS洗涤3次后重悬于binding buffer，加入Annexin-V-FITC和碘化丙啶溶液避光染色30 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡率，Annexin V阳性为早期凋亡细胞，Annexin V和碘化丙啶双阳性为晚期凋亡细胞。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 HOXA10在NSCLC中呈高表达

与人胚肺成纤维细胞MRC-5相比，HOXA10在人肺癌细胞A549和PC-9中呈高表达，差异有统计学意义（P=0.030 3，P=0.001 2），表明HOXA10在NSCLC细胞中呈高表达。见图1。

图1 HOXA10在NSCLC细胞中的表达水平Fig.1 Expression of HOXA10 in NSCLC cell lines

2.2 敲低HOXA10降低安罗替尼在A549和PC-9细胞中的半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）

为了进一步研究HOXA10对安罗替尼药物敏感性的影响，分别将si-NC和si-HOXA10转染至A549和PC-9细胞。细胞转染后48 h，采用Western blotting检测HOXA10表达水平。与转染si-NC的A549和PC-9细胞相比，转染si-HOXA10的细胞中HOXA10表达水平显著降低，见图2A。

将转染后的细胞以不同浓度（1、2、4、8、10、15、25、50、95 μg/mL）安罗替尼处理24 h，采用CCK-8法检测细胞增殖活性，结果显示，敲低HOXA10的A549和PC-9细胞的生存率显著低于对照组（P<0.05），说明安罗替尼对敲低HOXA10的细胞增殖有抑制作用。见图2B。此外，敲低HOXA10会降低安罗替尼 在A549和PC-9细胞中的IC50，si-NC-A549细 胞和si-HOXA10-A549细胞中安罗替尼的IC50分别为（35.29±3.24）和（18.33±2.07）μg/mL，si-NC-PC-9细胞和si-HOXA10-PC-9细胞中安罗替尼的IC50分别为（24.32±4.06）和（10.31± 2.83）μg/mL，差异均有统计学意义（P<0.001）。

图2 敲低HOXA10降低安罗替尼在A549和PC-9细胞中的IC50Fig.2 Half-maximal inhibitory concentration（IC50）of anlotinib after HOXA10 knockdown in A549 and PC-9 cells

2.3 敲低HOXA10后安罗替尼对细胞增殖的抑制作用增强

克隆形成实验结果表明，A549和PC-9细胞中，未经处理的转染si-NC的细胞（si-NC组）、未经处理的转染si-HOXA10的细胞（si-HOXA10组）、经4 μg/mL安罗替尼处理的细胞（Anlotinib组）比较，细胞增殖抑制率的差异无统计学意义（均P>0.05），经4 μg/mL安罗替尼处理的转染si-HOXA10的细胞（si-HOXA10+anlotinib组）与上述3组细胞比较，细胞增殖抑制率明显增高（均P<0.05），说明敲低HOXA10后安罗替尼对细胞增殖的抑制作用增强。见图3。

图3 敲低HOXA10后安罗替尼对细胞增殖抑制作用增强Fig.3 Inhibition of cell proliferation by anlotinib is enhanced after HOXA10 knockdown

2.4 敲低HOXA10后安罗替尼对细胞迁移和侵袭的抑制作用增强

Transwell细胞迁移和侵袭实验表明，A549和PC-9细胞中，未经处理的转染si-NC的细胞（si-NC组）、未经处理的转染si-HOXA10的细胞（si-HOXA10组）、经4 μg/mL安罗替尼处理的细胞（Anlotinib组）比较，细胞迁移和侵袭相对数量的差异无统计学意义（均P>0.05），经4 μg/mL安罗替尼处理的转染si-HOXA10的细胞（si-HOXA10+anlotinib组）与上述3组细胞比较，细胞迁移和侵袭相对数量明显降低（均P<0.05），说明敲低HOXA10后安罗替尼对细胞迁移和侵袭的抑制作用增强。见图4。

图4 敲低HOXA10后安罗替尼对细胞迁移和侵袭抑制作用增强Fig.4 Anlotinib-induced inhibition of cell migration and invasion is enhanced after HOXA10 knockdown

2.5 敲低HOXA10促进安罗替尼诱导的细胞凋亡

流式细胞术结果（图5）显示，8 μg/mL安罗替尼诱导转染si-NC的A549或PC-9细胞凋亡。未经处理的si-NC-A549细胞凋亡率为（14.14±3.9）%；经安罗替尼处理的si-NC-A549细胞凋亡率为（15.11±4.2）%；未经处理的si-HOXA10-A549细胞凋亡率为（18.63±3.8）%；经安罗替尼处理的si-HOXA10-A549细胞凋亡率为（36.9±4.5）%；未经处理的si-NC-PC-9细胞凋亡率为（16.31±4.2）%；经安罗替尼处理的si-NC-PC-9细胞凋亡率为（16.59±3.7）%；未经处理的si-HOXA10-PC-9细胞凋亡率为（20.78±3.8）%；经安罗替尼处理的si-HOXA10-PC-9细胞凋亡率为（32.31±3.9）%。与对照组相比，相同浓度安罗替尼显著上调敲低HOXA10的A549或PC-9细胞的凋亡率，差异有统计学意义（均P<0.001）。结果表明，敲低HOXA10促进安罗替尼诱导的细胞凋亡。

图5 敲低HOXA10促进安罗替尼诱导的细胞凋亡Fig.5 Anlotinib-induced apoptosis is enhanced after HOXA10 knockdown

3 讨论

肿瘤耐药性在晚期NSCLC患者的治疗中几乎无法避免。尽管第一代酪氨酸激酶抑制剂吉菲替尼、厄洛替尼和埃克替尼等被证明能够有效治疗NSCLC，但研究［7］发现，在中位治疗时间10个月后患者会出现耐药问题。近年来研究发现，肿瘤耐药是多种基因共同作用的结果，鉴定相关耐药分子并阐明其作用机制，对增加肿瘤细胞药物敏感性、提高临床疗效十分重要。

HOXA10属于同源异型盒基因家族，该家族成员多为转录因子，以高度保守的DNA结合结构域调控下游目的基因表达［8］。HOX基因家族许多成员在肿瘤中异常表达，参与调控肿瘤的发生、发展。HOXA10在多种恶性肿瘤中发挥促癌基因功能［9-10］。研究［11］发现，HOXA10在NSCLC中高表达，然而其作用机制尚不清楚。本研究通过实时定量PCR检测NSCLC细胞中HOXA10表达水平，结果表明HOXA10在NSCLC细胞中呈高表达，与最新临床样本分析［12］结果一致。

临床研究［4-5］证实，安罗替尼作为三线抗肿瘤药物可有效提高晚期NSCLC患者的总生存期。机制研究［13］发现，安罗替尼通过抑制趋化因子CCL2而抑制血管生成，血清CCL2水平是潜在的NSCLC预后指标。基于RNA测序技术的转录组学分析［6］发现，肺癌细胞中CXC趋化因子配体2（C-X-C motif ligand 2，CXCL2）与安罗替尼耐药性相关。在安罗替尼敏感的NCI-H1975细胞中，安罗替尼可以显著下调CXCL2水平；而在耐药细胞中，安罗替尼对CXCL2表达水平无明显影响。后续功能实验［6］验证了CXCL2对安罗替尼耐药性的影响。值得注意的是，转录组学分析［6］也发现HOXA10在安罗替尼敏感细胞中可被安罗替尼显著下调，而在耐药细胞中无明显变化，提示HOXA10与NSCLC安罗替尼敏感性相关。

与NCI-H1975细胞相比，A549和PC-9细胞对安罗替尼的敏感性相对较差。因此，本研究选择了这2个细胞系用于研究安罗替尼耐药性。本研究通过敲低HOXA10，首次探讨了其与安罗替尼药物敏感性的关系。由于本研究使用了浓度较低的安洛尼替处理细胞，在对照组未观察到安罗替尼对细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的明显抑制作用。而CCK-8和克隆形成实验证实，敲低HOXA10显著增加安罗替尼的细胞毒性，增强其抑制细胞增殖的作用。Transwell实验发现，在HOXA10低表达细胞中，安罗替尼抑制细胞迁移和侵袭的能力明显增强。此外，流式细胞术结果表明，敲低HOXA10促进安罗替尼诱导的细胞凋亡。由此可见，敲低HOXA10可提高A549和PC-9细胞对安罗替尼的敏感性。由于肿瘤细胞耐药机制比较复杂，后续还需要通过动物体内实验进一步验证。

综上所述，本研究发现HOXA10在NSCLC中对增强安罗替尼敏感性起关键作用，为提高安罗替尼治疗效果提供了新的思路。