连续计数法血小板功能检测的方法学评价及质量控制研究进展

王崇 王丽娴 秦娜 秦云静 袁茵 赵建宏

连续计数法血小板功能检测(sequential platelet counting method,SPCM)是国内于2012年研发的一种基于库尔特原理的新型血小板聚集功能评价实验[2],其检测原理为:通过连续动态测量全血标本在添加诱聚剂(Agonist)前后血小板数量及体积变化,综合分析血小板最大聚集率(maximum aggregation rate,MAR)、平均聚集率(average aggregation rate,AAR)、最大聚集时间(maximum aggregation time,MAT)、血小板聚集曲线(platelet aggregation curve,PAC)、血小板抑制率(PLT inhibition rate,INH)、血小板平均抑制率(PLT average inhibition rate,A-INH)、红细胞最大聚集率(RBC maximum aggregation rate,R-MAR)等参数,对血小板在不同诱聚剂诱导下的聚集功能进行较为全面的评价[2,3],进而指导临床选择患者较为敏感的抗血小板药物。本文拟对连续计数法血小板功能检测与其他方法进行比较,分析各自优缺点,并对SPCM的影响因素及质量改进提出建议。

1 方法学比较

1.1 SPCM与LTA LTA做为一种传统的血小板聚集功能实验,最初由Salzman于1960年提出[4],其原理为通过离心将标本分为富血小板血浆(Platelet rich plasma,PRP)和贫血小板血浆(Platelet poor plasma,PPP),用PPP将PRP的血小板计数调整至250×109个/L,在其中加入不同种类的诱聚剂,如花生四烯酸(arachidonic acid,AA)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、胶原(Collagen,Col)、肾上腺素(Epinephrine,EPI)等,诱导血小板聚集,引发血浆浊度变化,通过检测血浆透光率的动态变化,计算血小板聚集率。其优点是:市场应用广泛,临床认可度高,试剂价格相对较低;检测结果准确、重复性好,血浆浊度变化的检测为不间断连续线性测定,能准确捕捉到透光率最大、浊度最低、血小板最大聚集的时间点。但亦有明显的缺点,因其检测血浆浊度变化,一些影响血浆透光度的因素,均会对检测结果产生影响;标本检测前需要离心,会诱导血小板活化,且分离血浆,去除红、白细胞后,非全血环境,不能准确、全面反应血小板在体内活化、粘附、聚集功能;因实验前需要对标本进行提取贫、富血小板血浆等手工操作,检测人员操作的熟练程度对结果会有影响,不利于实验操作全过程自动化;不同实验室间、不同实验操作人员对同一份标本的检测结果也会有差异。

SPCM与LTA相比较,具有以下优势:标本不需要离心,没有实验前手工操作步骤,减少了手工操作误差的干扰,容易实现实验全过程自动化、批量化,提高检测效率;不分离血浆,不去除红、白细胞,最大程度还原血小板体内的全血环境,真实反映血小板的活化状态;SPCM通过对加入诱聚集前、后不同时间点的血小板计数来计算PLT最大聚集率,轻度的溶血、黄疸、脂血、乳糜血对检测结果无影响。不足之处是SPCM为固定时间点检测,即在加诱聚剂前进行1～2次血小板计数检测,以此次血小板测定结果或2次测定结果的平均值为基数;加诱聚剂后300 s、380 s、460 s再进行3次血小板计数,以其中血小板数量最少、聚集程度最大时间点的血小板计数结果计算最大聚集率。不同于LTA的不间断的连续浊度测定,其所谓的“连续”其实是抓取5个时间“点”对血小板进行测定,不能精确捕捉到血小板“最大聚集”发生的时间点,从实验设计原理上来讲,重复性不如LTA稳定。尤其对于服用抗血小板药物过量导致的最大聚集时间延迟的患者,因血小板尚未达到最大聚集程度便在460 s结束测定,会导致测定结果偏低。

吴小利等[2]对以连续测定法为原理的江苏英诺华医疗技术有限公司生产的PL-11血小板聚集仪的日间、批内、批间的不精密度、准确性、携带污染率及线性性能进行了评价,结果显示:SPCM法与LTA法有一定相关性(r=0.62,P<0.01);各项检测结果均符合美国《临床实验室改进修正法案-88》(Clinical Laboratory Improvement Amendment 88,CLIA’88)的要求,结论为连续测定法血小板功能检测是一种较理想的、适用于血栓病早期预警和诊断实验方法,值得推广应用,与张有涛等[5,6]的研究结果一致。

1.2 SPCM与IPA IPA又称全血电阻抗法,最早于1980年提出[7],标本不需要离心,全血测定,其原理为在全血样本中加入诱聚剂,使血小板活化,粘附聚集于电极,使电阻抗增加、电流减小,通过记录电流的变化曲线来评价血小板聚集功能[7,8]。与SPCM一样,二者均直接使用抗凝全血,标本不需要离心,避免手工操作干扰,能最大程度反应血小板在全血环境下的功能状态[9],不同于SPCM的“固定时间点”检测,IPA可连续监测因血小板聚集导致的电流减少、电阻抗增加,能准确捕捉血小板最大聚集率发生的时间点,重复性优于SPCM;但IPA每次实验都需要清洗电极,日常维护要求高,且易受血小板数量及红细胞压积(hematocrit,HCT)影响,血小板及红细胞数量偏低的患者,IPA电流变化不明显,实验灵敏度偏低。IPA对微小凝集不敏感,对轻度血小板功能障碍敏感度较低,故IPA多用于实验研究,临床应用较少[9]。

SPCM日常维护简单,实验环境要求不高,对实验前PLT的微小凝集可通过质控参数“原始血小板平均体积MPV-0”进行预警,当MPV-0≥11 fl时提示有PLT凝集或小红细胞干扰。HCT对SPCM的影响可通过矫正公式进行调整,当HCT≤20%或HCT≥55%时,按矫正公式:抗凝剂(ml)=(100-HCT)×血液(ml)×0.00185对抗凝剂进行调节[10]。PLT数量明显减少时,如PLT<50×109/L,会导致SPCM检测的重复性变差。

1.3 SPCM与TEG TEG是血栓弹力仪描绘出的凝血动态过程曲线,能动态分析血小板、凝血因子、纤维蛋白原等血液成分之间相互作用、血凝块形成和纤维蛋白溶解全过程的曲线图[11]。最早由德国人Harret于1948年提出[11],其原理为:体外模拟静脉血流,全血或血浆复钙后,激活凝血系统,反应杯中的金属针感应血栓形成及溶解过程中的应切力,由计算机绘制血栓形成速度、强度及溶解曲线[12],以此反映凝血及纤溶过程的全貌。一般分普通杯检测、肝素酶杯检测和血小板功能杯检测3种检测方式。主要参数包括:反应时间(R)、凝固时间(K)、两侧曲线最宽距离(MA)、血块稳定性(LY30)、预测纤溶指数(EPL);MA反应血小板功能,MA≥70 mm表示血小板功能较强,发生血栓的风险较高;MA≤50 mm表示血小板功能较弱,出血的风险较大[12]。但MA除反映血小板功能外,还受纤维蛋白原的影响,反应血小板功能特异性方面不如SPCM。对于低纤维蛋白原血症患者,不能真实反映血小板功能及活化状态,可能干扰临床对抗血小板药物的使用评价。另外,MA与LTA法检测血小板聚集率的相关性方面仍存争议[12]。

TEG的优点是可床旁全血检测,操作简单,重复性好,除了可以通过监测MA宽度,评价血小板功能及抗血小板药物的治疗效果外,还可全面检测患者凝血及纤溶系统是否异常,综合评估出血和血栓风险[12]。但正因为TEG反映的是凝血、纤溶的全过程,包括纤维蛋白的形成速度、溶解状态、血栓的坚固性及弹力度等。整个反应过程除血小板外,还有凝血酶、凝血因子、纤维蛋白原、纤溶酶等参与血栓的形成与溶解过程,影响因素较多[13],且凝血酶形成后是血小板的强激活剂,因此,普通杯MA值不能反映抗血小板药的用药效果,只能通过血小板杯MA差值对抗血小板药效进行评估。黄武明[14]比较血栓弹力图法与比浊法在冠心病患者血小板功能检测中的应用效果发现,二者相关性较差,检测一致性也较弱,仅对高血脂患者两种方法有较好的相关性。

SPCM是在全血样本中加入诱聚剂后,通过比较加入诱聚剂前后血小板数量的变化来计算血小板最大聚集率,不受凝血因子、纤维蛋白原、凝血酶及纤溶酶等因素影响,在评价血小板功能的特异性方面优于TEG;但血小板膜上有多种活化通路受体,SPCM仅适合对AA、ADP、Col、EPI等特定诱聚剂类药物的治疗效果进行评价,不能代表PLT整体功能水平,尤其是长期服用抗血小板药物的患者,因此,在综合评估患者出血和血栓风险方面TEG优于SPCM。

1.4 SPCM与VASP VASP为血小板内蛋白,在基础状态下处于非磷酸化状态,当P2Y12受体被ADP激活后,VASP被蛋白激酶磷酸化,在对血小板膜通透化处理后,加入抗VASP磷酸化荧光抗体,采用流式细胞术对VASP进行定量分析[15]。优点是P2Y12信号通路特异性强,实验结果与LTA相关性较好,但不能检测其他血小板活化通路;SPCM除可检测ADP诱导的P2Y12信号通路外,还可对AA、Col、EPI活化的其他通路进行检测;VASP流式法操作较为复杂,费用较高,多用于实验研究,临床应用较少。

1.5 SPCM与VerifyNow VerifyNow快速血小板功能检测仪于2006年由美国食品药品管理局批准,用于血小板功能检测,由美国Accumetrics公司生产,其原理为:反应杯中含有血小板激活剂(AA、ADP、凝血酶受体激活肽)及纤维蛋白原包被的微粒,加入全血后,血小板被激活剂活化,其表面的糖蛋白IIb/IIIa受体与微粒表面的纤维蛋白原结合,血小板吸附于微粒表面,使反应杯透光率增加,根据浊度的下降来评价血小板功能。其优点为全血检测,标本用量少,操作简单,可床旁测定,可评价AA、ADP、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂的治疗效果[16],欧美国家应用较多。但其以凝血酶作为聚集基线,干扰了血小板其他的聚集通路,不能代表血小板的最大聚集能力。SPCM也是全血检测,根据加入诱聚剂前后血小板计数的减少为依据,来进行血小板最大聚集率的计算,不激活凝血系统,不受凝血酶的影响,操作也较简单,更有利于临床应用。

1.6 SPCM与PFA-200 PFA-200是德国SIEMENS公司生产的一款血小板功能分析仪,其检测原理为:根据血液动力学原理,在体外模拟体内血管损伤后血小板的粘附与聚集过程,利用小孔闭合时间来反应血小板的功能状态[17]。具体过程为:将全血标本吸入富含胶原纤维、肾上腺素或ADP等血小板诱聚剂的孔隙中,在剪切力的作用下,测定血栓封闭孔隙的时间,以反应血小板的最大聚集率,多用于检测先天性或获得性血小板聚集、粘附功能障碍性疾病,也可用于抗血小板药物疗效监测。其优点为标本用量少、检测时间短、可床旁检测,可检测血小板的粘附功能[18];但标准化差,对血流动力学的过度依赖影响检测的准确性。

SPCM相对PAF-200更易全流程标准化,标本采集后,直接全血上机检测,无中间手工操作环节,不受血流动力学影响,但仅能对血小板的聚集功能进行评价,无法监测PLT的粘附功能。

1.7 SPCM与流式细胞术 流式细胞术利用荧光标记抗体可检测单个血小板上的不同标记物,对全血标本中悬浮血小板快速进行表型分析[19],相较于其他血小板功能检测方法有如下优点:全血检测、标本用量少、可检测PLT表面不同受体表达及对PLT反应性进行测试,尤其对于血小板减少症患者,检测结果准确可靠,明显优于其他血小板功能检测方法;但溶血产生的RBC碎片会干扰PLT的识别,影响检测结果[20]。SPCM同样是全血检测,可对不同诱聚剂下血小板功能进行检测,但不能对PLT表面受体进行分析,对PLT数量较少的标本,实验结果的重复性差。

2 SPCM检测影响因素分析

2.1 校准品与溯源 连续计数法血小板功能分析仪生产厂家较少,没有统一规范的校准品生产及使用标准,多为各公司专用校准品,一般分低(≤100×109/L)、中[(130～240)×109/L]、高(≥330×109/L)3种不同浓度水平,无明确溯源链,部分生产厂家用美国伯乐公司的全血质控品进行替代;除新装机时要求必须进行校准外,在使用过程中并未规定校准周期,只有当质控结果发生明显偏离时,才进行校准,校准的目的也是对仪器的检测系统、电子系统进行补正,保证系统精度,而对靶值的偏差要求不高,一般在±10%左右即可接受,这可能与检验结果为“血小板聚集率”,报告以比值形式体现有关,对检测的准确度要求不高,而对检测的稳定性要求较高。但对于血小板减少症患者,血小板绝对数测量不准会严重影响实验结果的稳定性。

检验科血常规分析仪血小板校准品多溯源到国际血液学标准委员会(international council for standardization in heamatology,ICSH),溯源链明确,结果可靠,重复性好。在日常工作中经常遇到连续计数法血小板功能分析仪与血常规分析仪对同一患者的血小板测定结果不同,给临床带来困扰。当二者结果不一致时,建议以血常规分析仪结果为准,原因如下:血常规分析仪血小板校准品有明确的溯源链,每天进行室内质控,按要求参加室间质评,检测结果有保证;连续计数法血小板功能分析仪关注的是血小板功能,检测结果是以最大聚集率来表达,对血小板计数的绝对值要求并不高。故在日常工作中遇到血小板功能分析仪与血常规分析仪对同一患者的血小板测定结果不同时,应以血常规分析仪结果为准。血小板校准品的溯源性是保证检测结果准确的基础,建议生产厂家参考血常规分析仪,使用有溯源性的校准品对血小板功能分析仪进行校准,减少与血常规血小板的计数误差。

2.2 质控品 连续计数法血小板功能分析仪质控品多为各生产厂家配套质控品,非第三方质控,一般为经特殊处理的动物细胞颗粒,不同厂家所生产的质控品技术要求、生产工艺、添加物及基质效应不同,无统一标准,仅供其自身检测系统使用,决定了不同品牌仪器的血小板最大聚集率检测结果只能相互参考,无法互认。建议统一使用第三方质控品,增加检测结果的准确度及稳定性,促进不同品牌间检测结果互认。

2.3 诱聚剂效能对检测结果的干扰 要保证检测结果准确,除血小板计数稳定外,检测前必须对诱聚剂效能进行验证,即检测健康志愿者新鲜血浆时,最大聚集率应不低于30%,否则诱聚剂失效。但目前尚无厂家在试剂说明书中明确要求每批测定前都要进行诱聚剂效能监测,在日常工作中,操作人员经常不进行诱聚剂效能检测就直接测定患者标本。

诱聚剂性质不稳定或部分失效会导致检验结果偏低[21],最常见的是花生四烯酸复溶后效能损失,花生四烯酸在复溶后2～8℃密封存放可稳定3 d,但常温8～30℃仅可稳定8 h,超出保存稳定期,诱聚剂效能会明显下降,影响诱聚效果,导致血小板最大聚集率结果偏低。建议各厂家规范说明书实验操作流程,在检测前对诱聚剂效能进行验证。

2.4 小红细胞或红细胞碎片的干扰 连续监测法将MPV-0做为一个质控指标,当MPV-0明显超出正常范围,如MPV-0≥11 fL时,提示在诱聚剂加入前已经发生血小板聚集,需重新采样。但在使用过程中发现部分黄疸患者,红细胞膜硬度增大,溶血剂不能完全溶解红细胞,仪器对部分未充分溶解的小红细胞或红细胞碎片会误计为血小板,导致MPV-0明显增大,影响结果判断。当仪器发出MPV-0异常提示时,建议检查患者其他血清或血浆标本,查看是否有溶血、黄疸、脂血、乳糜血等干扰,也可查看患者血常规结果是否有小红细胞及红细胞碎片等异常提示。

2.5 标本放置时间 朱远等[22]通过研究发现标本不同放置时间对连续计数法血小板功能检测结果有影响,以花生四烯酸为诱聚剂时影响较小,但以ADP 或胶原为诱聚剂时,随着标本放置时间的延长,血小板聚集率降低。因此,建议以花生四烯酸为诱聚剂时,血小板功能检测应在采血后4 h内完成;以ADP或胶原为诱聚剂时,应在采血后 2 h内完成检测。Zhu等[23]以LTA方法检测血小板功能,建议标本检测时间最好控制在采血后30 min至2 h,不宜超过4 h。程卫红[24]用全自动血细胞分析仪对70名健康人血小板参数进行分析,发现随着放置时间的延长,血小板的各项参数随之升高,采集4 h后影响更加明显。

2.6 采血不畅和标本运输过程中震荡 无论采血不畅还是标本运输过程中震荡,均可刺激血小板体外激活,导致血小板最大聚集率和平均聚集率测定结果偏高,差异有统计学意义[25]。为避免采血对血小板活化的干扰,应合理进行采血排序,避免血小板功能检测排采血第一管。血小板功能检测结果是临床上判断抗血小板药物疗效的重要指标,故在标本采集及运输过程中应保证采集顺畅,避免剧烈的震荡,以免影响临床对抗血小板药物疗效的评估。

3 小结与展望

急性血栓性疾病是临床多发病,具有突发性强、致残率高、致死率高等特点[26]。当血管破裂或内皮损伤时,内皮下胶原蛋白、组织因子、血管性血友病因子(von Willebrand disease factor,vWF)暴露,在激活内、外源凝血系统的同时,也激活静息状态下的血小板,活化的血小板通过vWF粘附到受损的血管内皮,实现一期止血。活化血小板表面丰富的磷脂提供了催化凝血瀑布级联反应的场所,导致大量凝血酶生成,水解纤维蛋白原为纤维蛋白,实现二期止血。活化血小板还可释放血栓烷(TXA2)、二磷酸腺苷(ADP)及炎性因子[27],通过第二信使刺激更多血小板吸附、聚集,促进凝血酶的生成,放大凝血作用,形成血栓[28]。因此,临床及时的抗血小板药物干预,对抑制及预防血栓形成有重要意义。

临床上通常用抗血小板药物来降低血小板反应性,阻止血栓形成,减少和预防心、脑血管卒中事件的发生;根据药物作用靶点不同,临床常用抗血小板药物分为:环氧酶抑制剂,代表药物为阿司匹林、吲哚布芬;二磷酸腺苷受体拮抗药,代表药物为氯吡格雷、替格瑞洛;血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂,代表药物为替罗非班[29]。抗血小板药存在个体差异,即血小板反应多样性[30],根据患者服用抗血小板药物后的反应,分为血小板高反应性(high platelet reactivity,HPR)和血小板低反应性(low platelet reactivity,LPR),HPR指患者对该抗血小板药物不敏感,或用药量不够,血小板活性抑制不足,发生血栓风险较高;LPR指患者对该抗血小板药物敏感,或用药过量,血小板活性过度抑制,出血风险较高[31]。临床医生必须根据血小板功能检测结果进行用药调整,以减少多种强效抗血小板药物联合使用导致的出血不良事件[32]。2011年美国心脏病学会基金会(American College of Cardiology Foundation,ACCF)及美国心脏学会(American Heart Association,AHA)提出对不稳定型心绞痛(Unstable angina,UA)及非ST段抬高心肌梗死(Non-st-segment elevation myocardial infarction,NSTEMI)患者在服用抗血小板药物治疗时要进行血小板功能检测的建议[33]。

目前,临床实验室血小板功能检测方法主要包括光电比浊法(light transmittance aggregometry,LTA)、电阻抗法(impedance platelet aggregometry,IPA)、血栓弹力图法(thromboelastography,TEG)、血管舒张剂刺激磷酸蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein,VASP)测定法、VerifyNow测定法、PAF-200小孔闭合时间测定法、流式细胞术测定法等,以LTA法应用最为广泛,被认为是血小板功能检测的“金标准”[34]。其他实验方法的检验结果也多与LTA进行比较,但因原理及操作程序不同,不同方法学测定结果之间缺乏可比性[35]。如王曦[36]研究了各种方法之间的相关性,LTA 与血栓弹力图的相关系数为 0.6(P<0.05),LTA 与Verify-Now 的相关系数为0.693,血栓弹力图与 Verify-Now的相关系数为 0.564(P<0.05),实验结果之间虽有相关性,但相关系数均不高。各种血小板功能检测方法总体临床预测价值不高,各方法的ROC曲线下面积为0.5～0.63,敏感度及特异性均<65%,且不能预测患者出血风险[37]。

综上所述,尽管血小板功能检测有多种方法,但因实验设计原理不同,各有优缺点。LTA应用最广,因排除了RBC干扰,通过动态监测血浆浊度的变化反映PLT聚集功能,实验结果重复性好,但影响血浆透光率的因素,如溶血、脂血、黄疸、乳糜血会干扰检测结果,且离心会诱导PLT活化,在非全血环境下,不能准确、全面反映PLT在体内活化、粘附、聚集、释放功能;因操作熟练程度的不同,手工提取贫、富血小板血浆也会对实验结果产生一定的影响。IPA具有操作简单、全血检测、无需离心、标本用量少等优点,能最大程度反应血小板在全血环境下的功能状态,但电极日常维护要求高,易受PLT数量及HCT影响,对轻度血小板功能障碍敏感度较低,多用于科研,临床应用较少。TEG通过对凝血纤溶过程曲线分析,可动态反映血栓形成及溶解整个过程,PLT只是参与因子之一,对PLT功能的评价受其他因素,如纤维蛋白原、凝血因子等的影响[38]。VASP对PLT膜表面P2Y12信号通路特异性强[39],但不能检测其他PLT活化通路,不能全面、完整反映PLT功能,多用于实验研究。VerifyNow快速血小板功能检测仪操作简单,标本用量少,可评价AA、ADP、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂的治疗效果[40],但其实验原理以凝血酶作为聚集基线,检测结果受纤维蛋白原及凝血酶影响较大。PAF-200利用小孔闭合时间来反应PLT的功能状态,标本用量少、检测快速、可同时检测血小板粘附功能,但受血流动力学的影响较大,重复性差。流式细胞术利用荧光标记抗体对PLT进行表型分析,干扰因素少,特异性好,特别适用于血小板减少症患者,但溶血产生的RBC碎片干扰实验结果。因此,为临床提供一种检测结果准确、重复性好,能真实反映体内血小板活化状态的实验方法,尤为重要。

连续计数法血小板功能检测是近年来开展的一项评价血小板聚集功能的新技术,操作简单,易于自动化,与传统“金标准”光电比浊法有较好的相关性。杨雅薇等[41]的研究显示,SPCM、Verify-Now、血栓弹力图、VASP检测的血小板抑制率结果有一定的相关性,但SPCM在实验设计及质量控制方面还需改进与完善,比如可以通过增加“固定时间点”检测次数提高检测结果的稳定性;在明确校准品溯源路径、在说明书或SOP文件中规范诱聚集效能评价标准、合理应用第三方质控品进行日常室内质控监测、减小与血常规分析仪PLT计数误差、增强不同实验室间结果互认等方面,需要进一步规范与完善。除以上影响因素外,血小板聚集功能检测还受血小板自身不稳定的影响,标本采血是否顺畅、震荡、存放时间及温度、临床用药等均可导致血小板功能变化,对异常结果的判读一定要结合临床,与临床医生、采血护士充分沟通,了解临床用药、排除采血干扰后才能正确审核。