盐酸克林霉素胶囊随机开放两周期两交叉的人体生物等效性试验

贾彩云 赵娜 宋浩静 万青华 许玉芳 胡义亭 郭彩会 董占军

1966 年由Magerlein等首次合成克林霉素,作用机制为作用于敏感菌核糖体50S亚基,抑制细菌细胞的蛋白质合成[1]。克林霉素是治疗金黄色葡萄球菌骨髓炎的首选药物,对需氧革兰阳性球菌有较高抗菌活性,如葡萄球菌属(包括耐青霉素及甲氧西林敏感株)、草绿色链球菌等;对厌氧菌也有抗菌作用,如梭形杆菌属、消化链球菌等[2]。盐酸克林霉素胃肠道吸收迅速,分布广泛[3,4]。多次给药无药物蓄积现象,血透及腹透不能清除克林霉素[5,6]。参考《以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则》[7],本研究选用石药集团欧意药业有限公司研发的克林霉素胶囊为受试者制剂,美国法玛西亚普强公司(Pharmacia &UpjohnCo) 生产的盐酸克CLEOCIN HCL为参比制剂,进行人体生物等效性临床试验。

1 资料与方法

1.1 一般资料 试验方案经河北省人民医院伦理委员会批准。试验中的所有受试者均在充分了解试验的目的、方法及风险后,自愿签署知情同意书,年龄≥18岁,体重指数 18.0～26.0 kg/m2,进行体格检查和实验室检测后合格的受试者随机纳入空腹试验24例,餐后试验24 例。空腹组年龄( 27.3±4.6) 岁,体重指数(22.56±1.89) kg/m2。餐后组年龄(25.7±4.1) 岁,体重指数(22.51±1.87) kg/m2。完成例数:空腹试验完成23例,1例受试者无脱落;餐后试验完成24例,无脱落/剔除。

1.2 纳入标准 (1)年龄>18周岁的女性和男性受试者; (2)女性体重≥45.0 kg,男性体重≥50.0 kg,体重指数(BMI)在19.0～26.0 kg/m2(包括临界值);(3)体格检查、生命体征检查、12导联心电图、胸部X片、心脏彩超检查、实验室检测及酒精呼气检测,结果正常或异常无临床意义者;(4)没有心血管系统、消化系统、泌尿系统、精神神经系统异常及代谢异常等病史。

1.3 排除标准 (1)对克林霉素或其他相关药物(如林可霉素)有过敏史者;(2)有胃肠道疾病史或(和)存在吞咽困难者;(3)在筛选前3个月内接受过手术治疗,或者近期有手术计划者,及既往接受过任何有可能会影响药物代谢的手术者;(4)筛选前14 d内发生腹泻者;(5)有晕针晕血史者,不能耐受静脉穿刺者;(6)筛选前6个月内有药物滥用史者;(7)筛选前3个月内使用过毒品;(8)筛选前3个月内入组了其他药物临床试验或参加过其他的药物临床试验;(9)筛选前3个月内有献血史者或失血≥200 ml者;(10)筛选前30 d内使用过任何抑制或诱导肝脏对药物代谢的药物者,给药前14 d内使用过任何处方药、非处方药、中草药、和维生素者等。

1.4 药品 克林霉素胶囊受试制剂[T,规格:0.15 g/片,石药集团欧意药业有限公司生产,批号:国药准字H13020795]; 克林霉素胶囊参比制剂[R,规格:0.15 g/片,Pharmacia and Upjohn Co生产,批号:SGYM]。克林霉素化学对照品(纯度94.7%,批号137371),Dr.Ehrenstorfer公司生产;盐酸克林霉素-d3(内标,纯度96.0%,批号:9-AKS-149-2),Toronto Research Chemicals Inc公司生产。空白基质,抗凝剂为肝素钠的空白人血浆和全血(考察全血稳定性)来自中国健康志愿者捐献。甲醇(HPLC级)购于美国Fisher Chemical公司,乙腈(HPLC级)购于美国Fisher Chemical公司,甲酸(MS级)购于美国Honeywell公司。

1.5 给药方案与血样采集

1.5.1 本研究为在健康成年受试者中进行的单中心、单剂量、随机、开放、双周期、自身交叉对照试验设计,评价克林霉素胶囊在空腹及高脂餐后两种状态下的生物等效性研究[8]。每周期给药1次,健康受试者随机分为2组,每组人数相等,

1.5.2 空腹组和餐后组受试者各24人,随机分为2组进行,交叉给药(12人/组),口服克林霉素胶囊受试制剂和参比制剂0.15 g,隔洗脱 7 d,每周期第1天服药。空腹组受试者空腹过夜 >10 h,服用相应受试制剂,240 ml 水送服,在服药0 h(服药前1 h内)和服药后10 min,20 min,30 min,45 min,1.00 h,1 h 20 min,1 h 40 min,2.00 h,2 h 30 min,3.00 h,4.00 h,5.00 h,6.00 h,8.00 h,12.00 h,24.00 h共17个时间点采集静脉血,每次4 ml至EDTA-K2抗凝真空采血管中。餐后组受试者空腹过夜>10 h,于第2天早上在服药前 30 min 开始高脂(提供食物中约50%的热量)高热量(约800～1 000 kcal)餐[9](30 min 内结束进餐),在进餐后且以开始进餐时间计的30 min时服用相应受试制剂或参比制剂,240 ml水送服,在服药0 h(餐后至服药前)和服药后0.25 h,0.50 h,0.75 h,1.00 h,1.50 h,2.00 h,2.50 h,3.00 h,3.50 h,4.00 h,4.50 h,5.00 h,6.00 h,8.00 h,10.00 h,12.00 h,24.00 h共18个时间点采集静脉血,每次4 ml至EDTA-K2抗凝真空采血管中。见表1。

1.5.3 空腹组和餐后组所采集的血样在1 h内4℃条件下离心(1 700 g,10 min),从采血至离心的时间全程置于冰浴中,所有离心后血浆样品将被分成两份,2 h内存放于≤-60℃冰箱中,以供药代动力学分析。

1.6 测定方法与血样处理

1.6.1 色谱条件:色谱柱:SHIMADZU,Shim-packGIST,C8,3 μm,2.1*50 mm;流动相:0.1%甲酸水(A)-100% 乙腈(B),梯度洗[0～0.30 min,20.0%;0.30～2.00 min,20.0% B→40.0% B ;2.00～2.01 min,40% B～90.0% B;2.01～2.60 min,95% B;2.60～2.61 min,95%B～20.0% B;2.61～3.10 min,20%B],流速:流速:0.400 ml/min; 柱温:40℃;分析时间为3.10 min; 进样量:2.0 μl。

1.6.2 质谱条件:电喷雾离子源,正离子方式检测(ESI+);监测方式:MRM 模式;接口温度:300℃;脱溶剂管温度:250℃;加热块温度:400℃;雾化器流量:3 L/min;加热器流量:10 L/min;干燥器流量:10 L/min。克林霉素离子对为425.10/126.10,驻留时间为150.0 ms,预四级杆偏转电压偏差Q1 Pre为-13.0V,碰撞能量(CE)为-30.0 eV,预四级杆偏转电压偏差Q3 Pre为-24.0 V;克林霉素-d3离子对 428.10/129.10,驻留时间为150.0ms,Q1 Pre为-10.0 V,CE为-29.0eV,Q3 Pre 为-20.0 V。

1.6.3 血浆样品处理:样品室温下融化后,涡旋混匀,取30.0 μl样品(校正标样,质控样品或测试样品;对于双空白样品或QC0样品,加入30.0 μl空白基质)至96孔板中,对于双空白样品及不含内标的定量上限样品加入30.0 μl 50% MeOH;其他样品加入30.0 μl内标溶液,摇匀;加入300 μl的100%MeOH,然后摇匀,约10 min,在约4℃条件下2 600×g离心10 min;转移100.0 μl上清液至新的96孔板中,加入400 μl H2O,然后摇匀,约5 min,待进样。

1.7 方法学考察 克林霉素在组织、体液或细胞中含量测定的方法报道较多。常用的有微生物法[10,11]、放射免疫分析法(RIA)、分光光度法[12]、气相色谱法(GC)[13]、液相色谱法(HPLC)[14]、反相高效液相法(RP-HPLC)[15]或高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)[16]等。本文采用的LC-MS/MS方法具有灵敏度高、选择性高、分析速度快、使用范围广等特点,液质联用法的方法学验证由苏州国辰生物科技股份有限公司生物分析部完成。

1.8 统计学分析 应用Phoenix WinNonlin软件(Certara USA Inc,7.0)对血药浓度进行非房室模型药代动力学参数的估算分析,计算主要药代动力学参数,使用SAS 9.2软件进行生物等效性评价,将药代动力学参数 Cmax、AUC0-t、AUC0-∞ 经对数转换后,进行方差分析和90%置信区间分析,Tmax用非参数法进行统计分析。

2 结果

2.1 血浆中内源性物质不干扰克林霉素的测定 克林霉素的标准曲线10.0～2 500 ng/ml,该范围内,以克林霉素峰面积与克林霉素-d3峰面积之比与克林霉素和克林霉素-d3浓度比作线性回归方程,权重因子采取1/C2,R>0.99,R2>0.985。血浆样品中克林霉素的提取回收率为93.4%～94.7%,内标克林霉素-d3 的回收率为 92.8%。克林霉素在10～2 500 ng/ml浓度,稀释因子为 1∶10 时具有良好的稀释可靠性。血浆样本在-20℃条件下储存28 d的稳定性良好,-60℃条件下储存29 d稳定性良好;血浆样本在-60℃条件下经历5次冷冻-解冻循环的稳定性良好;血浆样本在处理前室温白光条件下放置25 h以及提取后进样器(温度设置:4℃)放置120 h稳定性良好;全血样本于冰浴白光下放置2 h的稳定性良好; 基质效应(包括溶血基质效应与高脂基质效应)、残留均不影响血浆中克林霉素的准确定量。方法学验证结果表明本方法可用于临床试验血浆样品的分析。见表2。

表2 血浆中克林霉素的精密度和准确度

2.2 受试者入组及完成情况 空腹组24例健康受试者参加试验,其中1例因不良事件退出,未参加第2周期,剩余23例受试者均按照方案要求完成试验;餐后组24例健康受试者入组。

2.3 血药浓度-时间曲线 空腹组和餐后组受试者口服受试制剂和参比制剂后,克林霉素的平均血药浓度-时间曲线。见图1。

图1 受试者服用受试制剂(T) 和参比制剂(R)后克林霉素均血药浓度-时间曲线

2.4 药代动力学参数 健康空腹组和餐后组受试者口服克林霉素胶囊受试制剂和参比制剂的的主要药代动力学参数。见表3。

表3 空腹和餐后受试者口服受试制剂和参比制剂后的主要药代动力学参数

2.5 生物等效性分析 口服克林霉素受试药物和参比药物在空腹状态下的Cmax、AUC0-t及 AUC0-∞的几何均值的比值分别为92.29%,95.32%和95.59%,90% CI分别为 84.12%～101.27%,90.14%～100.79%和90.49%～100.98%,个体内变异分别为18.42%,11.03% 和10.83%。在餐后状态下 Cmax、AUC0-t及AUC0-∞的几何均值的比值分别为95.79%,100.92%和101.65%,90% CI 分 别 为87.75%～104.56%,93.48%～108.95%,个体内变异分别为17.81%,15.54% 和15.67%。同参比制剂比较,受试制剂Cmax、AUC0-t及 AUC0-∞的 90% 置信区间均落在参比制剂的80.00%～125.00%,说明两种制剂具有生物等效性。

2.6 安全性评价 空腹服用受试制剂后,共4例(17.4%)受试者发生9例次不良事件,2例(8.7%)受试者发生6例次药物不良反应。服用参比制剂后,共3例(12.5%)受试者发生4例次不良事件,3例(12.5%)受试者发生4例次药物不良反应。服用受试制剂或参比制剂后均无严重、导致死亡和退出的不良事件和药物不良反应发生,餐后服用受试制剂后,共2例(8.3%)受试者发生4例次不良事件。服用参比制剂后,共3例(12.5%)受试者发生5例次不良事件。不良事件均为Ⅰ级(NCI CTCAE 5.0)。服用受试制剂或参比制剂后均无药物不良反应、严重、导致死亡和退出的不良事件和药物不良反应发生,两制剂的安全性基本一致。

3 讨论

克林霉素是临床常用的抗生素,属林可酰胺类抗生素。与林可霉素抗菌谱相同,其抗菌活性更强。与林可霉素比较,克林霉素的抗菌活性增强4～8 倍,常用于敏感革兰阳性球菌和厌氧菌引起的感染,是β-内酰胺类过敏患者的首选药物。国内目前测定克林霉素的血药浓度的方法:微生物法,灵敏度低,专属性差,较难真正反映药物在人体内血药浓度变化情况;液质联用的方法,灵敏度高,成本较高,难以普及。目前多采用液质联用测定血浆药物浓度。

本试验采用乙晴沉淀,盐酸克林霉素-d3做内标,LCMS/MS法测定血浆中克林霉素浓度并进行生物利用度及生物等效性研究。本试验中,空腹口服受克林霉素胶囊试制剂和参比制剂Tmax中位数为0.5 h(0.33～1.33 h)、0.75 h(0.33～1.33 h);餐后口服克林霉霉素胶囊受试制剂和参比制剂后Tmax中位数为3.5 h(1.00～4.51 h)、2.50 h(0.50～4.00 h)。消除半衰期为3～4 h,表明克林霉素口服吸收快速完全,组织穿透性良好。与文献报道一致。本试验中的受试制剂 Cmax、AUC0-t及 AUC0-∞ 的90% 置信区间均落在参比制剂80.00%-125.00% 内,表明本试验达到生物等效。受试制剂盐酸克林霉素胶囊与参比制剂CLEOCIN HCL在中国健康成年受试者中,在空腹和餐后状态下单次口服给药,安全性较好。空腹状态下服用受试制剂后,共4例(17.4%)受试者发生9例次不良事件,2例(8.7%)受试者发生6例次药物不良反应。服用参比制剂后,共3例(12.5%)受试者发生4例次不良事件,3例(12.5%)受试者发生4例次药物不良反应。服用受试制剂或参比制剂后均无严重、导致死亡和退出的不良事件和药物不良反应发生,两制剂的安全性基本一致。餐后状态下服用受试制剂后,共2例(8.3%)受试者发生4例次不良事件。服用参比制剂后,共3例(12.5%)受试者发生5例次不良事件。不良事件均为Ⅰ级(NCI CTCAE 5.0)。服用受试制剂或参比制剂后均无药物不良反应、严重、导致死亡和退出的不良事件和药物不良反应发生,两制剂的安全性基本一致。

两制剂在空腹和餐后给药后药时曲线相似,所发生的不良事件及发生率均相似。经生物等效性评价,两制剂生物等效。