大孔吸附树脂分离纯化白子菜总黄酮工艺优化

于 凤，许凯歌，许秋双，李天祥

（天津中医药大学，天津 301617）

白子菜为菊科菊三七属植物，2010 年被批准为新食品原料，全草入药［1-2］，具有降尿酸［3］、抗痛风［4］、治疗2 型糖尿病［5-7］、胰岛素抵抗［8-9］、治疗脂肪肝［10-11］、增强胃肠蠕动［12］等功效，并且活性成分丰富，包括黄酮、生物碱、酚酸［13］。课题组前期发现，白子菜黄酮有着显著的降低血尿酸作用。

黄酮分离纯化方法诸多，以大孔吸附树脂为主［14］，它作为一种绿色环保材料在中药材、中药制剂方面应用广泛［15-20］，但目前尚未涉及白子菜总黄酮。因此，本实验考察了HPD600、AB-8、ADS-7、D101、DM301 型大孔吸附树脂对白子菜总黄酮的吸附性能，并优化该成分分离纯化工艺，以期为其药理活性研究及相关制剂开发奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 HNY-200F 型恒温培养振荡器（天津市欧诺仪器仪表有限公司）；UV-6100 PCS 型紫外分光光度计（上海美普达仪器有限公司）；DT5-1型低速台式离心机（北京时代北利离心机有限公司）；R-1001N 型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 试剂与药物 芦丁对照品（批号1009H022，纯度≥98%，北京索莱宝科技有限公司）。ZTC1+1Ⅱ型天然澄清剂（A、B 组分，武汉振天成科技有限公司）。HPD600、AB-8、ADS-7、D101、DM301型大孔吸附树脂（北京索莱宝科技有限公司）。硫酸、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠为分析纯；无水乙醇为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）；水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.3 药材 白子菜于2020 年9 月采自天津种质资源圃，经天津中医药大学李天祥教授鉴定为菊科植物白子菜Gynuradivaricate（L.） DC.。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取干燥至恒重的芦丁对照品3.140 2 mg，置于25 mL 棕色量瓶中，60%乙醇溶解，即得（该成分质量浓度为0.125 6 mg／mL），精密吸取0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于10 mL 量瓶中，60%乙醇定容，制成系列质量浓度。

2.1.2 线性关系考察 精密吸取不同质量浓度对照品溶液各0.5 mL，置于10 mL 量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.4 mL，摇匀，静置5 min，加入10%Al （NO3）3溶液0.4 mL，摇匀，静置5 min，加入4%NaOH 溶液5 mL，摇匀，静置5 min，以相应试剂为空白，在510 nm 波长处测定吸光度。以对照品质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A＝0.012 1X+0.002 6 （r＝0.999 8），在12.56～251.2 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.1.3 上样液制备 称取白子菜粉末300 g，20倍量60%乙醇浸泡30 min，回流提取1 h，共2 次，滤过，合并滤液，回收溶剂，制备0.2 g／mL 醇提液，置于50 ℃水浴锅中，缓慢加入4%B 组分（含ZTC1+1 Ⅱ型天然澄清剂） 并不断搅拌，水浴30 min，加入2%A 组分水浴20 min，每隔5 min 搅拌20 s，室温静置2 h，3 000 r／min 离心5 min，取上清液，即得。

2.1.4 测定方法 精密吸取0.5 mL 上样液，按“2.1.2” 项下方法测定3 次吸光度，取平均值，代入方程，计算总黄酮含量。

2.2 树脂预处理 取HPD600、AB-8、ADS-7、D101、DM301 型树脂适量，装柱（2 cm×30 cm），8 BV 2%NaOH 溶液以4 BV／h 体积流量冲洗2 h，蒸馏水冲洗至流出液呈中性，60 ℃水浴加热5 min，95%乙醇浸泡30 min，以3 BV／h 体积流量冲洗4 BV，2%HCl 浸泡30 min，以3 BV／h 体积流量冲洗4 BV，蒸馏水冲洗至流出液呈中性。

2.3 大孔吸附树脂筛选

2.3.1 静态吸附性能 称取预处理后抽滤至干的5 种树脂各1.5 g，置于具塞锥形瓶中，加入0.2 g／mL 上样液20 mL，置于恒温振荡培养箱（25 ℃、100 r／min） 中振荡3 h，滤过，取续滤液，测定吸附率，公式为吸附率＝［（C1-C2）／V1］ ×100%，其中C1为吸附前总黄酮质量浓度，C2为吸附后总黄酮质量浓度，V1为上样液体积。弃去上清液后，加入55%乙醇20 mL，置于恒温振荡培养箱中振荡3 h，取上清液，计算解吸率，公式为解吸率＝｛C3V2／［（C1-C2） ×V1］ ｝ ×100%，其中C3为解吸后总黄酮质量浓度，V2为解吸后溶液体积，结果见表1。由此可知，AB-8 型树脂吸附能力最强，HPD600 型树脂解吸能力最强。

表1 总黄酮在不同树脂上的静态吸附能力（±s，n＝3）Tab．1 Static adsorption capacities of total flavonoids on different resins （±s，n＝3）

表1 总黄酮在不同树脂上的静态吸附能力（±s，n＝3）Tab．1 Static adsorption capacities of total flavonoids on different resins （±s，n＝3）

型号吸附率／%解吸率／%DM-30182.08±0.2287.11±0.23 D10180.25±0.3687.41±0.29 ADS-780.81±0.1686.14±0.30 AB-884.75±0.2688.30±0.38 HPD60081.06±0.3090.72±0.09

2.3.2 动态吸附性能 称取预处理后抽滤至干的5 种树脂各3.0 g，装柱（1 cm×50 cm），40 mL 0.2 g／mL 上样液以3 BV／h 体积流量上样，收集流出液，4 BV 55% 乙醇洗脱，保持体积流量不变，收集洗脱液，计算吸附率、解吸率，结果见表2。由此可知，AB-8 型树脂吸附能力最强，HPD600型树脂解吸能力最强。

表2 总黄酮在不同树脂上的动态吸附能力（±s，n＝3）Tab．2 Dynamic adsorption capacities of total flavonoids on different resins （±s，n＝3）

表2 总黄酮在不同树脂上的动态吸附能力（±s，n＝3）Tab．2 Dynamic adsorption capacities of total flavonoids on different resins （±s，n＝3）

型号吸附率／%解吸率／%DM-30172.46±0.6790.27±0.24 D10171.09±0.2187.44±0.48 ADS-772.15±0.2490.47±0.42 AB-878.28±0.4589.12±0.25 HPD60074.20±0.4391.45±0.44

2.3.3 混合树脂吸附性能 分别按1 ∶0、2 ∶1、3 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 3、1 ∶ 2、0 ∶ 1 比例称取HPD600、AB-8 型树脂共3.0 g，混匀后装柱，40 mL 0.2 g／mL 上样液以4 BV／h 体积流量上样，收集流出液，计算吸附率，20 mL 55% 乙醇以4 BV／h 体积流量洗脱，收集洗脱液，计算解吸率，结果见表3。由此可知，两者比例为3 ∶2 时吸附性能最佳。

表3 不同比例混合树脂吸附性能（±s，n＝3）Tab．3 Adsorption capacities of mixed resins with different ratios （±s，n＝3）

表3 不同比例混合树脂吸附性能（±s，n＝3）Tab．3 Adsorption capacities of mixed resins with different ratios （±s，n＝3）

HPD600、AB-8 型树脂比例吸附率／%解吸率／%1 ∶083.14±0.0983.96±0.05 1 ∶185.98±0.0889.10±0.05 2 ∶183.88±0.0587.67±0.06 3 ∶286.71±0.0589.94±0.07 2 ∶385.05±0.0988.43±0.01 1 ∶284.88±0.0285.66±0.02 0 ∶184.16±0.0183.43±0.06

2.4 混合树脂吸附研究

2.4.1 生药量与混合树脂干重比例 称取HPD600 型树脂1.8 g、AB-8 型树脂1.2 g，共5份，混匀后装柱，设定生药量与混合树脂干重比例分别为1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1，分别量取0.2 g／mL 上样液7.5、15、30、45、60 mL，以4 BV／h 体积流量上样，收集流出液，计算总黄酮吸附率，结果见表4。由此可知，两者比例大于3 ∶1时吸附率迅速降低，表明吸附已饱和。

表4 生药量与混合树脂干重比例对总黄酮吸附率的影响（±s，n＝3）Tab．4 Effect of crude drug dosage-mixed resin dry weight ratio on adsorption rate of total flavonoids （±s，n＝3）

表4 生药量与混合树脂干重比例对总黄酮吸附率的影响（±s，n＝3）Tab．4 Effect of crude drug dosage-mixed resin dry weight ratio on adsorption rate of total flavonoids （±s，n＝3）

生药量与混合树脂干重比例吸附率／%1 ∶291.78±0.07 1 ∶191.68±0.06 2 ∶191.31±0.08 3 ∶189.92±0.09 4 ∶179.81±0.07

2.4.2 上样液质量浓度 称取HPD600 型树脂1.8 g、AB-8 型树脂1.2 g，共5 份，混匀后装柱，按“2.1.3” 项下方法制备上样液，取质量浓度为1.2 g／mL 者7.5 mL，蒸馏水依次稀释至0.075、0.15、0.3、0.6、1.2 g／mL，以4 BV／h 体积流量上样，收集流出液，计算总黄酮吸附率，结果见表5。由此可知，上样液质量浓度为0.3 g／mL 时药液流动性、混合树脂吸附性能较好，并且可避免药液浪费。

表5 上样液质量浓度对总黄酮吸附率的影响（±s，n＝3）Tab．5 Effect of sample solution concentration on adsorption rate of total flavonoids （±s，n＝3）

表5 上样液质量浓度对总黄酮吸附率的影响（±s，n＝3）Tab．5 Effect of sample solution concentration on adsorption rate of total flavonoids （±s，n＝3）

上样液质量浓度／（g·mL-1）吸附率／%0.07576.24±0.09 0.1581.64±0.04 0.385.82±0.04 0.687.02±0.07 1.287.97±0.04

2.4.3 上样体积流量 按“2.4.2” 项下方法装柱，取0.3 g／mL 上样液30 mL，分别以1、2、3、4、5 BV／h 体积流量上样，收集流出液，计算总黄酮吸附率，结果见图1。由此可知，体积流量为1、2 BV／h 时该成分吸附率较大，为了节省时间，最终确定为2 BV／h。

图1 上样体积流量对总黄酮吸附率的影响Fig．1 Effect of sample volumetric flow rate on adsorption rate of total flavonoids

2.5 混合树脂解吸研究

2.5.1 杂质洗脱液体积流量 按“2.4.3” 项下方法装柱、上样、收集流出液后，6 BV 蒸馏水分别以3、4、5、6、7、8 BV／h 体积流量除杂，6 BV 55%乙醇以4 BV／h 体积流量洗脱，收集洗脱液，计算总黄酮转移率，公式为转移率＝（Z2／Z1） ×100%，其中Z1为上样液中总黄酮含量，Z2为解吸液中总黄酮含量，结果见表6。由此可知，随着洗脱液体积流量增加，流出液颜色逐渐加深浑浊，为了提高解吸后溶液中总黄酮纯度并节约时间，最终确定为5 BV／h。

表6 杂质洗脱液体积流量对总黄酮转移率的影响（±s，n＝3）Tab．6 Effect of impurity eluent volumetric flow rate on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

表6 杂质洗脱液体积流量对总黄酮转移率的影响（±s，n＝3）Tab．6 Effect of impurity eluent volumetric flow rate on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

杂质洗脱液体积流量／（BV·h-1）转移率／%3 87.97±0.08 87.71±0.06 5 87.42±0.06 6 84.27±0.08 7 82.04±0.08 8 81.45±0.09 4

2.5.2 杂质洗脱液用量 按“2.5.1” 项下方法装柱、上样、收集流出液，分别用2、4、6、8、10、12 BV 蒸馏水以5 BV／h 体积流量除杂，6 BV 55%乙醇以4 BV／h 体积流量洗脱，收集洗脱液，计算总黄酮转移率，结果见表7。由此可知，洗脱液用量为8 BV 时流出液几乎无色澄清，表明树脂柱中杂质冲洗较完全。

表7 杂质洗脱液用量对总黄酮转移率的影响（±s，n＝3）Tab．7 Effect of impurity eluent consumption on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

表7 杂质洗脱液用量对总黄酮转移率的影响（±s，n＝3）Tab．7 Effect of impurity eluent consumption on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

杂质洗脱液用量／BV转移率／%2 85.94±0.07 85.48±0.09 6 84.64±0.07 8 84.53±0.09 1083.86±0.09 1283.72±0.09 4

2.5.3 洗脱剂体积分数 按“2.5.1” 项下方法装柱、上样，8 BV 蒸馏水以5 BV／h 体积流量除杂，分别用6 BV 10%、25%、40%、55%、70%、85%乙醇以4 BV／h 体积流量洗脱，收集洗脱液，计算转移率，结果见图2。由此可知，体积分数为70%时转移率显著升高，并且可节约试剂。

图2 洗脱剂体积分数对总黄酮转移率的影响Fig．2 Effect of eluent concentration on transfer rate of total flavonoids

2.5.4 洗脱剂体积流量 按“2.5.3” 项下方法装柱、上样、除杂，6 BV 70% 乙醇分别以1、2、3、4、5、6 BV／h 体积流量洗脱，收集洗脱液，计算转移率，结果见图3。由此可知，体积流量为1、2 BV／h 时转移率较高，为了节约时间，最终选择2 BV／h。

图3 洗脱剂体积流量对总黄酮转移率的影响Fig．3 Effect of eluent volumetric flow rate on transfer rate of total flavonoids

2.5.5 洗脱剂用量 按“2.5.3” 项下方法装柱、上样、除杂，分别用5、6、7、8、9 BV 70%乙醇以2 BV／h 体积流量洗脱，收集洗脱液，计算转移率，结果见表8。由此可知，用量大于4 BV 时转移率升高，而且逐渐平稳，为了节约试剂，最终选择8 BV。

表8 洗脱剂用量对总黄酮转移率的影响（±s，n＝3）Tab．8 Effect of eluent consumption on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

表8 洗脱剂用量对总黄酮转移率的影响（±s，n＝3）Tab．8 Effect of eluent consumption on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

乙醇用量／BV转移率／%4 73.75±0.09 80.81±0.07 6 86.02±0.08 7 88.61±0.09 8 89.73±0.07 9 91.01±0.09 5

2.6 验证试验 称取HPD600 型树脂1.8 g、AB-8型树脂1.2 g，混匀后装柱，30 mL 0.3 g／mL 上样液以2 BV／h 体积流量上样，8 BV 蒸馏水以5 BV／h体积流量除杂，8 BV 70%乙醇以2 BV／h 体积流量洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮含量，计算转移率；取3 份纯化前后上样液，每份10 mL，置于干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸至无液体流动，置于105 ℃烘箱中2 h，冷却干燥，称定质量，计算总黄酮纯度，公式为纯度＝（X／Y） ×100%，其中X为纯化前总黄酮含量，Y为样品液烘干后质量，结果见表9。由此可知，纯化后总黄酮纯度显著升高，表明该工艺稳定可靠。

表9 验证试验结果（n＝3）Tab．9 Results of verification tests （n＝3）

3 讨论

本实验发现，经95%乙醇浸泡并以1 BV／h 体积流量洗脱后，大孔吸附树脂再生处理效果较好；提取物大多残留在柱尾，并且较难洗脱，故可考虑逆向洗脱以再生树脂。

在考察检测波长时发现，芦丁对照品溶液、白子菜醇提液分别在510、507 nm 波长处有最大吸收，可能是由于后者所含成分复杂，造成波长略微蓝移，故选择510 nm 作为检测波长。在考察树脂吸附效果时发现，动态、静态解吸结果有所差异，可能是由于树脂球径不同而导致树脂和药液中物质接触面积、药液流动速度不一。在考察吸附条件时发现，药液酸性增加时变浑浊，有沉淀生成，并且析出的灰黑色物质中可能含有较多黄酮，故本实验不对上样液pH 进行调节。

验证试验发现，白子菜总黄酮转移率达89.67%，纯度由上样前的12.67%增加至70.63%，RSD 均小于5%，表明成本低廉、绿色环保的HPD600、AB-8 型大孔吸附树脂适用于该成分分离纯化，可为其开发利用提供有力支持。