基于高通量测序技术的林下三七土壤微生物多样性研究

熊冰杰何舒张澳黄佑国王美玲严星茹何霞红施蕊

(西南林业大学园林园艺学院/西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室/国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心/昆明生态林业产业国际科技研发中心，云南昆明 650224)

三七[Panax notoginseng(Burk.) F. H.Chen]为五加科人参属植物，具有活血化瘀、预防冠心病以及滋补强壮等功效[1-2]，在医药行业、化妆品行业、保健品行业备受欢迎，需求量逐年增加[3]。 三七通常以根部入药，近些年三七茎、花[4-6]也被广泛应用。 由于三七连作障碍严重[7-8]，近年来适宜种植三七的土地面积持续下降。 微生物是土壤生态系统的重要成分，与中药材之间存在共生关系。 土壤的营养状况会直接改变微生物的种群结构，调控中药材的药用活性[9]。 三七从土壤中吸收所需养分，土壤中微生物含量的多寡对三七的健康成长至关重要[10]。通过外源添加营养元素改善土壤的理化性质、微生物群落结构等，为植物创造良好的生长环境，可促进植物生长[9，11-13]。 土壤性质、微生物群落结构的改变影响植物的产量和品质，特定的土壤微生物群落结构对于稳定土壤结构和维持土壤生态功能至关重要[14-17]。

以碱性植烟土壤为试验材料进行深耕+有机肥处理后，土壤有机质、养分及酶活性升高[18]，“清香”核桃施专用肥后土壤氮、磷等含量明显增加[19]。 施肥量对土壤性质的影响各不相同，在适宜的范围内枇杷土壤的优势菌门丰度随施肥量的增加而增加，其中施肥枇杷土壤中的变形菌门丰度显著增加[20]。 蓖麻饼和蚯蚓粪的使用提高了土壤的酸性和磷酸盐、N、P、S 含量，加剧土壤的生物循环过程，从而提升植物的生长和产量[21]。蚯蚓粪不仅增加了番茄根际土壤微生物的数量，而且能够均衡生物菌群的种类[22]。 李晓英[23]研究发现，施用适量的生物质炭基液态肥能够改善杜鹃土壤的理化性质，促进杜鹃花的生长及提高其成花率和花期效果，使杜鹃花在形态和感官等方面的价值得到提升。 本课题组前期研究表明，施用适量有机肥后，林下三七品质明显提升，且主要活性成分含量增加，尤其是衡量三七质量标准的主要物质——萜类化合物。 为进一步探究生物菌有机肥对三七品质的影响，本研究以林下施有机肥的三七土壤为研究对象，分析三七土壤微生物的变化，以期为种植高品质三七提供栽培技术及理论依据。

1 材料与方法

试验在云南省昆明市寻甸县林下三七种植基地(N25°28'，E103°12'；海拔2 199 m)进行。

1.1 试验材料及处理

1.1.1 生物菌有机肥及施用量生物菌有机肥:以有机碳、生物菌、多肽类物质等为营养元素。

施肥方法及用量:在松树林下起垄时，将基肥均匀施于垄顶表面，与土壤拌匀，移栽三七种苗，在三七开花后追肥。 基肥量30 000 kg/hm2，追肥量4 200 kg/hm2。 以不施生物菌有机肥为对照。

1.1.2 样品采集采用五点取样法取2年生花蕾前的施肥(T)、不施肥(CK)处理三七样本(每处理样本3个重复)，同时收集每株三七根际土壤，20 目筛去除杂物，-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 土壤检测按照DNA 提取试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]基于CTAB 法提取DNA，使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和浓度，取适量DNA 于离心管中，用无菌水稀释至1 ng/μL，以稀释后的DNA 为模板，使用含有Barcode 的特异引物515F(5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R(5'-GGACTACNVGGGTWTCTAA-3')扩增样品的16S rDNA V4 区序列。PCR 反应体系:2×Phusion Master Mix 15 μL，正反向引物(2 μmol/L)各1.5 μL，gDNA 模板10 μL，加去离子水至30 μL。 扩增程序:98 ℃预变性1 min； 98 ℃变性10 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。 使用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，对目的条带使用胶回收试剂盒(Qiagen 公司) 回收产物。 使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建库试剂盒进行文库构建，经Qubit 和Q-PCR 定量，使用NovaSeq 6000 进行上机测序。

1.2.2 三七基本参数测量将取回的各处理三七植株用自来水冲洗干净根系后滤纸吸干表面水分。 使用直尺测量主根长度，记作根长；测量主根和茎接触部位至小叶柄下端的长度，记作株高；用电子天平称量根部鲜重，随后放入烘干机中烘干，称量干重。

1.2.3 三七次生代谢产物检测取0.1 g 三七(试验组T)粉末溶于1.2 mL 70%甲醇提取液中；溶解后放入4 ℃冰箱过夜，期间涡旋6 次；离心(转速12 000 r/min，10 min)后吸取上清，用微孔滤膜(0.22 μm)过滤并保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析；不施肥组(CK)与试验组做相同处理。

1.3 数据处理与分析

使用Qiime 软件计算多样性指数，R 软件绘制PCA 图、韦恩图、聚类图、KEGG 富集图，Cytoscape 软件绘制网状图，采用SPSS 19.0 进行土壤数据分析。 在UPLC-MS/MS 检测平台和自建数据库基础上，利用软件Analyst1.6.3 与多元统计相结合分析三七成分。

2 结果与分析

2.1 三七生长参数比较

由表1 可知，T 处理在株高、根长、根鲜重和根干重方面均高于CK，可见，施用生物菌有机肥可促进三七植株的生长。

2.2 土壤微生物多样性检测

2.2.1 有机肥对土壤细菌多样性的影响两处理的Shannon 指数在8.461～8.926 之间，Simpson指数在0.985 ～0.993 之间，说明两组样本中土壤细菌群落多样性较高，但差异不显著。 前人研究结果显示[20-22]，有机肥的施用能够改善土壤质量，促进植物生长，但在林下环境中施肥对土壤细菌多样性的影响并不明显。

使用PCA 对土壤细菌的变化做进一步分析(图1)，T 组和CK 组在第一主成分呈现分离；两组样本共有OTU 数2 663个，特有OTU 数分别为633 和749(图2)。 由PCA 和韦恩图可知，两组样本之间不仅存在相同之处也呈现各自特有的性状。

图1 土壤细菌群落PCA 分析图

图2 基于OTU 的韦恩图

2.2.2 有机肥对土壤细菌群落结构的影响在两组三七根际土壤中共检测到41 门、50 纲、119目、206 科、389 属和213 种。 在门水平上(表2)，林下三七土壤细菌主要包括变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)，这与前人研究[24-26]结果一致。 与CK 相比，T 处理中变形菌门(Proteobacteria，55.576%)、放线菌门(Actinobacteria，19.509%)丰度显著增加， 而酸杆菌门( Acidobacteria，12.267%)丰度降低。 变形菌门和放线菌门丰度的增加能够降解土壤中不易被分解的物质，增强土壤环境的抵抗能力，促进土壤微环境的循环[27]；同时能够促进植物根际分泌物的产生，加快林下腐殖土的分解。 在属水平上(表3)，与CK相比，T 处理组变形菌门(Proteobacteria)中的罗河杆菌属(Rhodanobacter)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)和放线菌门(Actinobacteria)中的节杆菌属(Arthrobacter)丰度明显增加，罗河杆菌属种群被证明对根腐真菌病原体腐皮镰孢霉菌(Fusarium solani)具有拮抗作用，并且可能参与氮循环过程。 酸杆菌门(Acidobacteria)中的Bryobacter丰度下降，马赛霉菌属(Massilia)的菌群丰度明显降低。

表2 基于门水平各样本前10 的土壤细菌优势群落占比

表3 基于属水平各样本前10 的土壤细菌优势群落占比

2.3 三七次生代谢产物检测

两组三七样本中共检测到664 种次生代谢产物，差异代谢物175 种，包括萜类、黄酮类、生物碱类、酚酸类、脂类、氨基酸及其衍生物等10 类次级代谢产物。 其中萜类差异代谢物11 种，黄酮类差异代谢物15 种，生物碱类差异代谢物11 种，酚酸类差异代谢物33 种(包括上调4 种，下调29 种)，脂类差异代谢物19 种，氨基酸及其衍生物20 种。在PCA 分析中(图3)，两组样本第一主成分明显分离，与三七根际土壤样本的检测结果相似。 聚类分析显示(图4)，两组样本中的高表达量物质种类不同。 由此可知，两组试验样本存在差异。

图3 三七次生代谢产物PCA 分析图

图4 样品聚类分析图

两组样本中被KEGG 注释到的代谢物有263个，其中差异显著的代谢物有84个。 KEGG 富集分析显示(图5)，代谢途径(metabolic pathways)和次生代谢产物合成途径(biosynthesis of secondary metabolites)富集到差异代谢物数量最多，分别为71个和37个。 咖啡因代谢途径(caffeine metabolism)及膦酸酯和次膦酸酯代谢(phosphonate and phosphinate metabolism)的富集因子为1，说明这两条通路富集显著。

图5 差异代谢物KEGG 富集图

酚类和萜类是高等植物的主要化感物质，酚类物质是造成土壤连作障碍的主要因素之一。 在检测到的175 种差异代谢物中，酚酸类物质占比最高。 表4 显示，2-(甲酰氨基)苯甲酸、对香豆酸、顺丁烯二酰基-咖啡酰奎宁酸、3-O-阿魏酰奎宁酸、异绿原酸C 在T 处理中未检测到，而3-氨基水杨酸在CK 处理中未检测到。 酚酸浓度在中高水平会引起膜结构损伤，相对较低浓度的苯甲酸对三七根的生长有促进作用，超过适量的浓度后就会抑制其生长[28-29]。

表4 三七中19 种酚酸类差异代谢物

2.4 土壤微生物与三七品质的关系

土壤中微生物菌群的变化直接影响三七的健康和效用。 利用土壤细菌与三七代谢物构建网状图(图6)，进一步分析土壤细菌与三七生长之间的关系。 在门水平上，6 种土壤细菌和41 种三七代谢产物相关。 例如，酸杆菌门与肌醇、单酰甘油酯(18∶1)、溶血磷脂酰胆碱18∶1 呈正相关，与对羟基扁桃腈、L-蛋氨酸、L-瓜氨酸呈负相关；疣微菌门与烟酸核糖核苷、2'-脱氧肌苷-5'-单磷酸呈正相关，与甲基马来酸、L-精氨酸、9-(阿拉伯糖基)次黄嘌呤、黄苷、鸟苷3'，5'-环单磷酸、溶血磷脂酰乙醇胺16∶0 呈负相关；Parcubacteria 与L-色氨酸、绿原酸甲酯正相关。 在属水平上，84 种土壤细菌和41 种三七次生代谢物相关。 例如，罗河杆菌属与延胡索酸(富马酸，反丁烯二酸)正相关，与D-木糖酸、3-羟丙基棕榈酸酯葡萄糖胺负相关；鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)与9-(阿拉伯糖基)次黄嘌呤、溶血磷脂酰乙醇胺16∶0 正相关，与D-果糖负相关；马赛霉菌属(Massilia)与咖啡酸、5-O-对香豆酰奎宁酸、3-O-对香豆酰奎宁酸、绿原酸、Ixerisoside D 正相关；藤黄单胞菌(Lu-teimonas)与咖啡酸、5-O-对香豆酰奎宁酸、3-O-对香豆酰奎宁酸、绿原酸、Ixerisoside D 负相关。以上说明，在不同菌群水平上，土壤微生物与酚酸类、萜类、黄酮类、有机酸、生物碱、氨基酸、脂类等代谢产物息息相关。

图6 土壤细菌与三七代谢物的相关性网状图

3 讨论与结论

施用化肥会使土壤板结、微生物多样性降低，外源施用有益菌是快速改变土壤质量的有效途径。 农家肥与秸秆配施可以提高土壤中变形菌门和放线菌门的相对丰度[30]，同时降低酸杆菌门的丰度，本研究与上述结果一致。 变形菌门、酸杆菌门、放线菌门是林下三七土壤中三大主要菌门。变形菌门具有固定氮源和清除污染物功能，有利于土壤物质的代谢[26]；放线菌门有利于土壤中有机残骸的分解[31]，增强环境抗胁迫能力[32]，促进植物吸收土壤中的养分。 这两种菌门丰度的增加，有助于缓解土壤的连作障碍。 本研究中处理组酸杆菌门丰度低于对照组，酸杆菌门的丰度越低土壤的品质越好[33]，该结论在穿心莲试验中也得到了证实[34]。 土壤中变形菌门、放线菌门和酸杆菌门等核心菌群丰度的变动有助于平衡土壤内部激素，促进植株生长，提升植物的抗病性和养分利用率[35-37]。

植物的生长与土壤、土壤微生物密不可分，土壤-微生物-植物三者形成一个微环境。 三七与土壤中的变形菌门、酸杆菌门、放线菌门之间存在着密不可分的关系。 施用适量有机肥后，土壤微生物群落发生了改变，同时改变了植物中酚酸类、类黄酮、脂类和生物碱类化合物的组成。 植物中代谢物变化最显著的是酚酸类物质，而酚酸类物质是重要的化感自毒物质，是引起植物连作障碍的关键因素之一[28]。 本试验中，处理组中酚酸类代谢物上调4 种，下调29 种。 2-(甲酰氨基)苯甲酸、对香豆酸、顺丁烯二酰基-咖啡酰奎宁酸、3-O-阿魏酰奎宁酸、异绿原酸C 在处理组中未检测到。 黄小芳等[38]研究发现，苯甲酸会改变植物根细胞的正常运转，导致植株体内的细胞活动错乱，抑制人参幼苗根部的生长；对香豆酸类酚酸物质可降低西洋参幼苗期的株高[39]，也可能存在抑制其他植物生长的作用[40-41]。 皂苷是三七中主要的有效成分，T 组中的皂苷含量多于CK 组，这说明施肥对三七的生长有益。 以上研究表明，有机肥对三七的有效生物量、次生代谢产物以及土壤微生物的种类、菌群丰度等都有影响。 对土壤细菌与代谢物的相关性网状分析显示，马赛霉菌属与5-O-对香豆酰奎宁酸、3-O-对香豆酰奎宁酸、咖啡酸呈正相关。 植物病原体能够增加咖啡酸的释放，降低土壤微生物的多样性[42]。 咖啡酸的富集表明三七植株可能受到了土传病原体的影响。 有行业学者指出[24]，三七的产量与皂苷量不仅与植物遗传因子有关，与三七的土壤环境也密不可分。

综上所述，施用适量有机肥有助于提升林下三七的土壤质量，缓解三七的连作障碍，本试验为进一步种植高品质林下三七奠定了基础。