基于PCR-HRM 的水稻氮高效基因NRT1.1B功能标记开发及应用

房文文王海凤郭涛薛芳姜艳芳张焕霞张士永

(山东省农业科学院湿地农业与生态研究所/山东省水稻工程技术研究中心，山东济南 250100)

水稻作为重要的粮食作物，稻谷的稳产与增产对粮食安全至关重要[1]。 氮素是水稻需求量最大的营养元素，也是制约水稻产量的关键因子[2]。 化肥尤其是氮肥的施用对水稻增产和改善稻米品质起了重要作用。 但近年来，氮肥施用过量已成为水稻生产中普遍存在的问题[3-4]，对生态环境造成了严重破坏[5]。 因此，培育养分高效型水稻新品种是解决这一问题的关键[6]。

研究表明，籼稻的氮肥利用率显著高于粳稻[7-8]。 培育和选育氮肥利用率高的粳稻品种是困扰育种工作者的难题。 Hu 等[9]研究揭示了籼、粳稻亚群氮肥利用差异的遗传基础，发现硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B单碱基变异是导致籼、粳稻间氮肥利用效率差异的主要原因，将籼型NRT1.1B导入粳稻能大幅度提高其氮利用效率，即在氮肥减半的条件下，产量较对照增加30%～33%，氮肥利用效率提高30%；在正常施肥条件下，增产8%～15%，氮肥利用效率提高约10%。

基因序列比对发现，籼稻中NRT1.1B基因编码区第980 位碱基为T，而其在粳稻中等位基因碱基为C，从而使编码蛋白的第327 位氨基酸分别为蛋氨酸和苏氨酸[9]。 根据NRT1.1B基因变异位点，方琳等[10]开发了特异性功能标记；牛付安等[11]开发了KASP 标记，并开展了氮高效粳稻育种。 本研究根据NRT1.1B基因的SNP 位点开发了一个用于HRM 检测方法的分子标记，并经测序方法验证标记的正确性，然后用其对78 份山东省地方品种进行NRT1.1B基因分型鉴定，为培育氮高效水稻新品种提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻材料包括NRT1.1B材料NM73、对照品种日本晴及78 份山东省地方品种。 NM73 由山东省农业科学院湿地农业与生态研究所李平波博士提供，其他水稻材料均由山东省种质资源团队收集和保存，以常规方法栽培。

试剂及仪器: 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，购于生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR 试剂，北京全式金生物技术(TransGen Biotech) 有限公司；EvaGreen qPCR 核酸染料，美国Biotium 公司。 SPX 智能型生化培养箱、RXZ-500C-LED 人工气候培养箱，宁波江南仪器厂；BCD-290W 型立式冰箱，青岛海尔股份有限公司；罗氏LightCycler96 实时荧光定量PCR 仪，Roche 公司。

1.2 NRT1.1B 基因序列分析及标记开发

对NRT1.1B基因序列进行分析，利用NRT1.1B与其等位基因及对照品种日本晴中的序列差异，应用Oligo 7 软件，根据差异的SNP 设计引物对。 引物均由华大基因公司合成。

1.3 DNA 提取、PCR 扩增及HRM 检测

采用CTAB 法[12]提取水稻样品的基因组DNA。 10 μL PCR 反应体系:2×EasyTaq®PCR SuperMix 母液5 μL，模板DNA 3 μL，正反向引物各0.2 μL(0.1 mmol/L)，20×Evagreen 0.125 μL，ddH2O 1.475 μL。 PCR 扩增程序:94 ℃预变性3 min；94 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环；最后72 ℃延伸10 min 后4 ℃保存。 扩增完成后，熔解曲线分析的程序为:95 ℃变性15 s；60 ℃退火15 s；以0.07 ℃/s 的速率升温，10 次/℃采集荧光信号，至90 ℃保持1 s。 采用Light Cycler 96 软件进行熔解曲线分析。

2 结果与分析

2.1 NRT1.1B 序列分析及功能标记的设计

根据NRT1.1B基因编码区第980 位的SNP变异位点设计分子标记，根据位点上下游基因序列设计了4 条引物，见表1。

表1 NRT1.1B 基因分子标记引物序列

2.2 功能标记的检测及方法

分别利用引物组合NRT1.1B-HRM -F1R1、NRT1.1B-HRM-F2R1、NRT1.1B-HRM-F2R2、NRT1.1B-HRM-F1R2 对日本晴和NM73 进行扩增分型，结果表明，利用NRT1.1B-HRM-F1R1 引物组合得到的熔解曲线比较平滑，能够对两种基因型的样品进行多态性区分(图1)。 最终选择NRT1.1B-HRM-F1R1 组合作为本研究后续试验采用的引物对。 利用日本晴和NM73 对筛选的引物对NRT1.1B-HRM-F1R1 的基因分型效果进行验证，能够检测出NM73 为含有NRT1.1B基因的高效单倍型，而日本晴为不含NRT1.1B基因的野生型。

图1 水稻NRT1.1B 基因熔解曲线结果

2.3 功能标记验证

进一步利用Li 等[13]开发的NRT1.1B标记NRT1.1B I1 ID 基于HRM 方法进行验证(图2)，分型结果与NRT1.1B-HRM-F1R1 一致。

图2 利用NRT1.1B I1 ID 标记检测NRT1.1B 基因

2.4 水稻品种中NRT1.1B 的检测

利用筛选的引物对检测78 份山东省地方水稻品种，共检测到13个品种为含有NRT1.1B基因(图3 和表2)的高效单倍型，其他65个品种均不含有NRT1.1B基因。 而且PCR 扩增后，仅需8 min 即可完成78个样品的NRT1.1B基因分型。

图3 山东地方水稻品种NRT1.1B 基因检测结果

表2 山东地方水稻品种NRT1.1B 基因分型结果

2.5 水稻材料NRT1.1B 基因型测序验证

为了验证NRT1.1B 标记检测的准确性，对10份水稻材料(紫皮水旱稻、青旱稻、铁耙子、水旱稻-2、粘稻、旱粘稻-1、小黄稻、竹秆青、大青秸-1和大红芒-1)的NRT1.1B基因进行PCR 扩增，然后测序，部分测序结果见图4。 其中，SNP 位点碱基是T 时，基因型为含NRT1.1B基因的高效单倍型；SNP 位点碱基是C 时，基因型为不含NRT1.1B基因的野生型。

图4 部分水稻材料NRT1.1B 基因SNP 位点的测序分型结果

对10 份材料的测序结果进行分析发现，6 份的基因型与NM73 相同，分别为紫皮水旱稻、青旱稻、铁耙子、水旱稻-2、粘稻和旱粘稻-1；4 份的基因型与日本晴相同，分别为小黄稻、竹秆青、大青秸-1 和大红芒-1。 测序结果与利用本研究开发标记得到的基因分型结果一致，即NRT1.1B 标记能够准确鉴定出含有NRT1.1B的材料，可为水稻氮高效基因育种提供技术支持。

3 讨论与结论

随着水稻功能基因组学的发展，已克隆了一个编码NAD(P)H 依赖型硝酸还原酶的OsNR2[14]，克隆了OsNRT2.2、OsNRT2.3a、OsNRT2.4、OsNRT2.3b和OsLHT1等多个水稻硝酸根吸收和转运基因[15-17]，鉴定了氮高效利用基因NRT1.1A[18]和Ef-cd[19]，兼具早熟、高产、氮高效育种应用价值，为氮高效分子育种提供了基因位点。

随着氮高效基因的挖掘，陶亚军等[20]对70份常规籼稻、34 份常规粳稻和84 份太湖资源水稻材料进行氮高效基因鉴定，发现OsNR2在籼稻中分布较广；OsNPF6.1、OsTCP19、OsGRF4在籼稻中分布较少且在常规粳稻中未被检出，常规粳稻中仅含有OsLHT1[21]；方琳等[10]对134 份粳稻品种进行NRT1.1B检测，发现均无高效基因型。 本研究通过开发用于HRM 方法的氮高效基因NRT1.1B的功能标记，并对78 份山东省地方品种进行NRT1.1B筛选，得到13 份含有NRT1.1B基因的高效单倍型材料。 这为水稻氮高效品种的培育提供了供体材料和技术支撑，可加快育种进程。

研究发现，聚合籼型OsNR2和NRT1.1B位点，氮利用效率比单个基因更高[20]。 下一步将针对该问题，开发可利用的功能标记，结合传统育种手段，对不同氮高效基因系进行聚合，以期将多个基因导入到主推的粳稻品种中，以提高氮利用效率。