石斛酚抑制黑色素瘤细胞增殖与迁移的作用以及潜在靶点miRNA的分析

向志宇，阿卜杜米吉提·艾海提，韩 雪，戴小华，史慧君，姚 刚

（新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052）

黑色素瘤，又称恶性黑色素瘤（malignant melanoma，MM），被称为“皮肤癌王”，是皮肤癌当中最危险的一种，增殖能力极强。近年来，动物黑色素瘤发病率逐渐升高，尤其是马属动物、猫、犬类。在年龄超过5 岁的灰马中，其发病率高达50%[1-2]。对马健康甚至马产业的发展造成巨大的影响。目前传统治疗黑色素瘤的药物只有少数几种，如达卡巴嗪、替莫唑胺和紫杉醇，但它们的有效率仍低于15%，治疗有效率低[3]。因此，急需研发新型防控黑色素瘤的药物。

石斛酚（Gigantol）是从几种药用兰花中分离出来的一种双苄基型酚类化合物。这种生物活性化合物已被证明具有显著的抗氧化、抗痉挛、抗炎作用和抗癌等功能[4]。研究表明石斛酚对多种癌细胞的恶性行为具有明显抑制作用，包括非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌等[5-7]。然而石斛酚对黑色素瘤的作用还未见报道。研究发现，microRNA（miRNA）在黑色素瘤恶性进展中扮演至关重要的角色[8]，因此，本研究试图探索石斛酚在黑色素瘤发生发展中的作用，并利用miRNA-seq 技术挖掘石斛酚的潜在靶点miRNA，进而揭示其对黑色素瘤发生发展的作用机制，以期为石斛酚应用于治疗黑色素瘤提供理论基础，从而减轻黑色素瘤对马健康与马产业的危害。

1 材料与方法

1.1 材料

供试石斛酚购自上海纯优生物科技有限公司；小鼠黑色瘤细胞B16购自中科院上海细胞库；Total RNA Extractor（Trizol）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Qubit2.0 RNA 检测试剂盒购自西安枫岭生物技术有限公司；CCK-8 试剂购自北京博奥森生物科技有限公司；DMSO 购自福州奥研实验器材有限责任公司；DMEM 高糖培养基、0.25%Trpsin&0.02%EDTA、青霉素-链霉素溶液和60 mm 细胞培养皿购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清FBS（货号04-001-1ACS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司；琼脂购自XHLY COMPANY LTD。

CO2细胞培养箱（型号CS170）购自北京东南信诚科技有限公司；酶标仪（型号150918C）购自上海普迈生物科技有限公司；Qubit2.0荧光计（型号Q32866）购自上海普瑾医疗科技有限公司；电泳仪（型号DYY-11）购自北京市六一仪器厂；台式高速低温离心机（型号Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 21R）购自上海朗赋实业有限公司；微量分光光度计（型号SMA4000）购自美林恒通（北京）仪器有限公司上海分公司。

1.2 方法

小鼠黑色素瘤细胞系B16用含有10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100 mg·mL-1链霉素的DMEM 高糖培养基培养，并在37 ℃、5%CO2条件下于恒温培养箱中培养。每1 d或2 d更换一次新鲜培养基。一旦细胞融合达到80%～90%就将细胞传代培养，并将第3 代细胞整合用于后面的实验。石斛酚使用0.004%DMSO 溶解，浓度为44 mmol·L-1，然后用DMEM高糖培养基稀释成相应的浓度，4 ℃备用。

将B16 细胞分成5 组，依次加0，40，80，160，320 μmol·L-1石斛酚处理24 h，用于CCK-8 检测和细胞划痕实验，即Control组、石斛酚组1、石斛酚组2、石斛酚组3和石斛酚组4。再将B16细胞分成2组，依次加0 μmol·L-1和160 μmol·L-1石斛酚处理24 h，收集细胞，用于RNA提取及miRNA测序实验，即Control组和石斛酚组。

1.2.1 CCK-8检测细胞增殖能力 将B16细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞接种量为每孔5×103个细胞，同时设置6个复孔，具体分组和石斛酚处理方式同上，处理完毕，每孔加入10 μL CCK-8试剂，放置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养2 h，在酶标仪上测定450 nm处的OD值。

1.2.2 划痕实验检测细胞迁移能力 将B16细胞接种于6孔细胞培养板中，细胞接种量为每孔5×103个细胞，同时设置3个复孔，具体分组和石斛酚处理方式同上，处理完毕，换为无血清培养基并加入1 μg·mL-1的丝裂霉素C处理1.5 h，再用200 μL pipette tip造成细胞划痕，除去细胞碎片，分别于培养0 h和24 h时进行显微镜拍照，并测量迁移距离和计算迁移率。

1.2.3 RNA的提取与验证 具体分组和石斛酚处理方式同上，收集处理完毕的细胞，加入裂解液后室温放置5～10 min，使得核蛋白与核酸完全分离；加入0.2 mL氯仿振荡15 s，室温放置3 min后于12 000 r·min-1离心10 min；吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20 min，12 000 r·min-1离心10 min弃上清；加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀12 000 r·min-1离心3 min弃上清；加入30～50 μL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA。Qubit2.0探针检测RNA浓度，1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.2.4 测序及数据预处理 提取Control组和石斛酚组的RNA，由上海生物工程股份有限公司进行质检，合格后，建立Small RNA文库，两组样本经PCR扩增及纯化、文库质检后上机测序。随后，将获得的原始数据进行过滤，并去除含有带接头的、低质量的序列，并根据miRNA特点，保留长度17～35 nt的reads，保证获得Clean数据。

1.2.5 差异miRNA的筛选 针对Control组和石斛酚组的Clean数据，利用R语言中的vegan package进行主成分分析PCA（principal component analysis）和样本间相似程度分析后，采用DESeq2进行分析，筛选条件设为：p≤0.05且差异倍数|FoldChange|≥2，从而获得两组间显著差异的miRNA。

1.2.6 miRNA靶基因预测及功能注释 利用miranda算法预测miRNA靶基因，预测miRNA靶基因过程中所使用到的阈值参数为：S≥150，ΔG≤-30 kcal·mol-1和Demandstrict 5'seed pairing，其中S指匹配区域内single-residuepair match scores；ΔG为双链形成时所需的自由能。选出靶基因后，进行GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）进行功能注释。

1.3 数据处理方法

实验数据均以平均数±标准差（X±S）表示，运用SPSS 25.0软件进行数据统计分析，多组样本间使用单因素方差分析，并采用LSD法进行多重比较；两组样本间使用t检验。p＜0.05视为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 石斛酚对黑色素瘤B16细胞增殖能力的影响

不同浓度石斛酚处理黑色素瘤B16 细胞24 h 后，利用CCK-8 试剂盒检测石斛酚对B16 细胞增殖能力的影响。结果表明，40，80，160，320 μmol·L-1对B16 细胞有明显的增殖抑制作用，通过统计学分析发现，与Control（0 μmol·L-1）组相比，40，80，160，320 μmol·L-1石斛酚对B16细胞增殖抑制作用有显著性差异，其中160 μmol·L-1和320 μmol·L-1石斛酚可极显著抑制B16细胞的增殖能力，且呈现浓度依赖性（表1）。

表1 不同浓度石斛酚对黑色素瘤B16细胞增殖的影响Table1 Effects of different concentrations of Gigantol on the proliferation of Melanoma B16 cells

2.2 石斛酚对黑色素瘤B16细胞迁移能力的影响

利用不同浓度石斛酚处理黑色素瘤B16细胞24 h后，进行细胞划痕实验，于划痕后0 h和24 h分别拍照，同时测量各组迁移距离并计算迁移率。结果表明，40，80，160，320 μmol·L-1石斛酚对B16细胞均具有一定的抑制作用（图1），经统计分析后发现，与Control（0 μmol·L-1）组相比，40 μmol·L-1和80 μmol·L-1石斛酚对B16细胞抑制作用无显著性差别，而160 μmol·L-1和320 μmol·L-1石斛酚可显著抑制B16细胞的迁移能力（表2）。

图1 石斛酚对黑色素瘤B16细胞迁移能力的影响Figure 1 Effect of Gigantol on melanoma B16 cells migration

表2 不同浓度石斛酚对B16细胞迁移能力的影响Table 2 Effects of Gigantol different concentrations on B16 cells migration

2.3 提纯与分离总RNA

根据CCK-8 和细胞迁移实验结果，利用Total RNA Extractor（Trizol）提取试剂盒提取空白对照组（Control）和160 μmol·L-1石斛酚组B16 细胞中的总RNA，经Qubit2.0探针检测RNA浓度后，采用琼脂糖凝胶检测RNA 完整性以及基因组污染情况。结果显示，Control 组和石斛酚组的3 个重复样本的18S 和28S 核糖体RNA 条带较为清晰，明暗度对比较强。另外一些低分子量的弥散性条带，代表存在tRNA、5S 核糖体RNA 以及其他mRNA 等（图2）。可见，本研究获得了高纯度的RNA，且没有被基因组污染，为后续miRNA测序奠定实验基础。

图2 琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性与污染情况Figure 2 Detection of RNA integrity and contamination by agarose gel electrophoresis

2.4 样本间相关性分析

本研究首先对Control 组和石斛酚组之间的Clean数据进行主成分分析，结果显示组间样本存在差别（图3A）。进一步采用样本相关热图展示样品间基因表达水平相关性，结果显示样本之间表达模式的相似度较高（图3B）。此结果表明检测实验较为可靠，且样本选择较为合理，为后续差异miRNA分析等奠定理论基础。

图3 样本间相关性分析结果Figure 3 Correlation analysis results between samples

2.5 miRNA差异化分析

探索差异表达miRNA有助于挖掘石斛酚治疗黑色素瘤的潜在靶向作用机制。实验结果显示，与Control组相比，石斛酚组显著上调表达42 个miRNA，显著下调表达11 个miRNA（图4A）。同时根据这53 个显著差异表达的miRNA 及比较组的Foldchange、P.Value、Q.Value值绘制热图（图4B）。除33个新预测到的miRNA 外，其余差异表达miRNA 共20 个，即与Control 组相比，石斛酚组中显著上调的miRNA 有mmu-miR-132-5p、mmumiR-144-3p、mmu-miR-212-3p、mmu-miR-5100、mmu-miR-6238、mmu-miR-6239、mmu-miR-6240、mmumiR-690、mmu-miR-6937-5p、mmu-miR-708-5p 和mmu-miR-708-3p；显著下调的miRNA 有mmu-miR-1191b-5p、mmu-miR-133a-3p、mmu-miR-3073a-5p、mmu-miR-3091-3p、mmu-miR-335-3p、mmu-miR-5128、mmu-miR-6539、mmu-miR-7661-3p 和mmu-miR-7667-5p。这一结果提示石斛酚可能通过调节这20 个差异表达miRNA来抑制黑色素瘤的发生与发展。

图4 差异miRNA分析Figure 4 Analysis of the Differential miRNA

2.6 GO富集分析

根据Control 组和石斛酚组差异表达的53 个miRNA 预测出来的靶基因共有2 050 个，对这些靶基因进行GO（gene ontology）分析。GO 相关3个ontology 中的top10富集结果显示，差异表达miRNA 靶基因的功能主要与轴突导向（axon guidance）、细胞质（cytoplasm）、DNA 结合（DNA binding）等有关（图5）。这一结果提示石斛酚可能通过差异表达miRNA来调控黑色素瘤细胞的多种生物学过程。

图5 差异miRNA靶基因GO注释分类柱状图Figure 5 Differential miRNA target gene GO annotation classification histogram

2.7 KEGG Pathway分析

本研究又进一步针对这53个差异表达miRNA靶基因进行KEGG Pathway分析，结果显示，这些靶基因主要涉及Rap1 信号通路（Rap1 signaling pathway）、钙信号通路（Calcium signaling pathway）、吗啡成瘾（Morphine addiction）以及磷脂酶D 信号通路（phospholipase D signaling pathway）等（图6）。综上表明，石斛酚可能通过调节肿瘤细胞中miRNA及其靶基因的表达，影响多种信号通路转导过程，从而缓解黑色素瘤的疾病进程。

图6 差异表达miRNA靶基因KEGG Pathway分析Figure 6 Differential expression of miRNA target gene KEGG Pathway analysis

3 讨论与结论

黑色素瘤位于马皮肤源性肿瘤的第3 位，是一种恶性肿瘤，在肿瘤研究发现黑色素瘤最常见于灰色马，尤其是年龄超过16周岁的老年马，其特征明显不同于其他颜色的马[9]。针对马黑色素瘤的治疗，肿瘤块的局部控制主要采用手术切除、病灶内化疗以及尝试使用西咪替丁、左旋咪唑等进行治疗，但效果仍不能满足现状。近年来研究发现马黑色素瘤的发病因素与多种分子异常有关，如STX17G基因突变、ASIPa和MC1RE的异常表达等，且有研究学者推荐了重要诊断生物标志物RACK1 和PNL2 等，以及潜在的治疗靶点CD47、PD-1 和COX-2等[2,10]。由此可见，继续基于分子改变挖掘治疗黑色素瘤的可能治疗药物及其作用靶点具有重要的临床意义。

石斛酚是一种从石斛属兰花中分离出来的双苄基型酚类化合物，现已被证明具有多种药理作用，包括抗癌，但其对黑色素瘤的作用机制尚未见相关报道。本研究采用0，40，80，160，320 μmol·L-1石斛酚处理B16 细胞，是根据前人研究石斛酚对膀胱癌和乳腺癌作用时使用的药物浓度而设定，且采用CCK-8 检测细胞增殖能力的结果显示，石斛酚对黑色素瘤B16细胞的增殖能力具有剂量依赖性的抑制作用；采用划痕实验检测细胞迁移能力的结果显示，石斛酚对黑色素瘤B16 细胞的迁移能力亦具有一定程度的抑制作用。以上研究结果与前人在其他癌中研究石斛酚的抗癌作用结果一致[6,11]。可见石斛酚极有可能是治疗黑色素瘤的潜在药物，但具体分子机制尚不清楚。

微小RNA（microRNA,miRNA）是一类长为20～25 个核苷酸的小分子，绝大多数miRNA 的初级转录本位于宿主基因的非编码翻译区，主要遵从经典miRNA 成熟途径，加工剪切成成熟体而发挥调控作用。此外miRNA存在于所有的真核细胞中，具有高度保守性，并且与癌症、心血管疾病、细胞外囊泡、神经退行性疾病等均密切相关[12]。研究表明miRNA 参与调节黑色素瘤细胞的生物学功能，包括细胞铁死亡[13]、细胞转移[14]等，因此本研究以miRNA为切入点来探讨石斛酚对黑色素瘤的潜在作用靶点。

本研究选用的小鼠黑色素瘤B16细胞为当前研究黑色素瘤机制的关键研究对象[15-16]，此细胞稳定无污染，且易于获得。根据CCK-8 结果计算的石斛酚处理B16 细胞24 h 时的IC50（IC50=133.6 μmol·L-1），同时划痕实验结果显示160 μmol·L-1时可显著抑制B16细胞的迁移，因此本研究最终选取160 μmol·L-1石斛酚处理B16细胞24 h进行后续测序分析。

分析53 个差异表达miRNA 靶基因，得到2 050 个靶基因，并对其进行GO 功能分析，结果显示，差异表达miRNA 靶基因功能主要是参与轴突导向、细胞质、DNA 结合等，KEGG 分析发现靶基因主要与Rap1 信号通路[17]、钙信号通路[18]、吗啡成瘾[19]以及磷脂酶D信号通路[20]等信号转导通路关系密切，而这些信号通路已被多项研究证实在黑色素瘤中发挥重要的作用。综上可见，石斛酚可能通过调节癌细胞中miRNA 表达来影响多种生物学过程及相关信号通路转导，进而发挥治疗黑色素瘤的作用。本研究结果有助于深入了解黑色素瘤的发病机制，可为石斛酚在马业临床治疗中提供强有力的理论依据。

石斛酚对黑色素瘤的恶性进展具有抑制作用，且利用Small RNA-seq 测序技术为马黑色素瘤发病机理及石斛酚临床推广应用提供了理论框架，筛选得到的差异表达miRNA 可能是治疗该疾病的关键分子。然而，目前本研究筛选得到的53 个差异表达miRNA 在黑色素瘤中的详细功能尚未被阐明，甚至有部分miRNA 的生物学功能至今未被揭示，未来需重点针对这些差异表达miRNA 的功能及调控机制展开石斛酚对黑色素瘤影响的相关研究。