黑色与红色毛山楂果实类黄酮化合物差异分析

张 枭，李培暠，王 键，付东旭，赵柏棚，董文轩，刘月学

（沈阳农业大学园艺学院，沈阳 110161）

山楂属（Crataegusspp.）为蔷薇科（Rosaceae）梨亚科（Pyreae）中一个古老的属[1]。中国的山楂属植物多达20个种，包含大量优异种质资源，其中栽培山楂以羽裂山楂大果变种（Crataegus pinnatifidavar.majorN.E.Br.）、湖北山楂（Crataegus hupehensisSarg.）、云南山楂[Crataegus scabrifolia（Franch.）Rehder]和伏山楂（Crataegus bretschneideriC.K.Schneid.）为主[2]。毛山楂（Crataegus maximowicziiC.K.Schneid.）为东北地区特有的野生近缘种，具有早熟、抗寒等优良特性。基于植物学特征及SCoT 分子标记结果发现，毛山楂与辽宁山楂（Crataegus sanguineaPall.）的亲缘关系较近[3]。简化基因组与叶绿体基因组数据结果则证实，毛山楂为伏山楂的母本基因来源[4-5]。此外，毛山楂与羽裂山楂大果变种、伏山楂等山楂属植物杂交可育，可作为选育栽培山楂新品种的亲本材料[6]。

类黄酮及其衍生物是山楂中含量最高、生物活性研究最多的一类化合物。山楂果实富含酚类、黄酮类、花青素等活性成分[7-8]，常用于食品和医药行业[9]。山楂富含的类黄酮及其衍生物主要包括黄酮类、黄酮醇类、黄烷醇类、黄烷酮类和其他苷类等。山楂黄酮类主要以牡荆素、芹菜素、牡荆素鼠李糖苷等为主；黄酮醇类主要包括芦丁、槲皮素、金丝桃苷等；黄烷醇类有儿茶素、表儿茶素、原花青素等；黄烷酮类主要包括柚皮苷等；其他苷类有矢车菊-3-O-半乳糖苷等[2]。

山楂作为丰富的酚类和黄酮类物质的来源，可被广泛用于预防或改善氧化引起的相关疾病[8]。山楂总酚或总黄酮的含量与其清除自由基的能力呈线性关系[10]。山楂80%乙醇提取物中含有原花青素B2、表儿茶素、绿原酸、金丝桃苷和异槲皮苷等物质，可显著提高CuZn-SOD 和CAT 的活性和mRNA 水平，揭示山楂可能通过增加内源性抗氧化酶的活性，从而实现其在体内的抗氧化机制[11]。山楂中的多酚和黄酮类化合物，也被证明对预防和治疗炎症有显著效果。LIU等[12]发现，从山楂提取的黄酮类化合物可以起到抗炎作用，缓解TNF-α诱发的Caco-2 细胞的肠上皮屏障缺失，改善上皮细胞的通透性。山楂中提取的低聚原花青素可减少促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的基因表达，最终缓解大鼠的促炎症免疫反应[13]。此外，山楂的多酚和黄酮类物质对于降低血糖具有一定的功效。相关研究发现，山楂80%甲醇提取物能够降低血糖水平，增加胰腺的血浆胰岛素释放，从而减轻高脂饮食诱导的血脂异常小鼠的糖尿病症状[14]。XIN等[15]发现山楂中的槲皮素和金丝桃苷是抑制α-葡萄糖苷酶的重要生物活性来源。山楂中提取的黄酮类化合物对链脲霉素诱导的大鼠糖尿病心肌病具有保护作用[16]。

黑色毛山楂为本团队前期从红色毛山楂中选出的果实黑色且富含类黄酮物质的实生后代资源[17]。本研究通过比较黑色与红色毛山楂果实色差值，结合超高效液相色谱质谱技术检测黑色与红色毛山楂果实类黄酮化合物种类及含量的差异，为富含黄酮类物质山楂新品种的选育，提升山楂果实品质提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验于2022年8月下旬，在国家山楂种质资源圃（沈阳）内采集毛山楂实生后代中的黑色毛山楂与红色毛山楂（图1）。每份资源从3 棵树上采集成熟度一致的果实，一部分用于果实色差值的测定，另一部分液氮速冻后-80 ℃低温保存，用于类黄酮物质含量的测定。

图1 黑色与红色毛山楂成熟果实Figure 1 The ripe fruits of black and red hawthorn (Crataegus maximowiczii)

供试标准品有矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside）、矢车菊-3-O-半乳糖苷（Cyanidin3-Ogalactoside）、原花青素（Proanthocyanidins）、原花青素B1（Proanthocyanidin B1）、儿茶素[(±)-Catechin hydrate]、表儿茶素[(-)-Epicatechin]、购自北京百灵威科技有限公司；芦丁（Rutin）、异槲皮素（Quercetin-3-glucoside）、金丝桃苷（Hyperoside）、绿原酸（Chlorogenic acid）和新绿原酸（Neochlorogenic acid），购自西格玛奥德里奇公司，纯度均为90%以上。

1.2 方法

1.2.1 山楂果实颜色的测定 使用LS170色差仪（深圳市林上科技有限公司）测定山楂果实亮度L*、色相a*与b*值。L*值衡量的是果实的亮度，0～100数值代表由暗到亮的过程。+a*到-a*值的转变过程代表红色减退、绿色增强；+b*到-b*值的转变过程代表黄色减退、蓝色增加[18]，并根据数据计算彩度值[C=（a*2+b*2）1/2]和色相角[h°=arctan（b*/a*）]。每份种质资源选择10个成熟度及大小一致的果实，果皮测定果实横径中央部位正面、对面和侧面3个点；果肉测定果实横截面中心部位3个点，取平均值。

1.2.2 山楂果实类黄酮物质的提取 山楂果实样品打碎或磨成粉末后，进行48 h冻干处理，将冻干粉末保存在-20 ℃下备用。准确称量20 mg样品，将其加入1 mL 80%甲醇水溶液（甲醇体积∶水体积=80∶20），4 ℃下用超声设备提取20 min，12 000 r·min-1离心12 min，取上清液转移至2 mL EP管内，重复3次，真空离心干燥，浓缩样品至EP管内。用甲醇400 μL定容，微孔滤膜过滤后检测。

1.2.3 色谱质谱采集条件Waters ACQUITY UPLC I-Class/Xevo G2-XS QTOF超高效液相色谱串联飞行时间质谱联用仪（Waters，USA）条件：色谱柱，ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0×150 mm，1.8 μm）；进样量为1 μL；流速为1.0 mL·min-1，柱温设定为30 ℃。流动相采用包含A（0.1%甲酸）和B（乙腈）的二元流动相系统。梯度洗脱的浓度梯度：0～1 min为5%B+95%A；1～8 min 为30%B+70%A；8～12 min为40%B+60%A；12～16 min为95%B+5%A；16～21 min 为100%B；21～25 min 为5%B+95%A。流动相的流速为400 μL·min-1。二极管阵列检测器进行全波长（200～500 nm）扫描，质谱系统为飞行时间质谱联用仪（Waters Xevo G2-XS QTOF，America）。ESI正离子模式进行全扫描分析，质量扫描范围100～1 500 m/z；脱溶剂气为N2；脱溶剂气温度400 ℃，脱溶剂气流量800 L·Hr-1，离子源温度150 ℃，锥孔电压30 V，为了获得丰富的碎片信息，碰撞电压为20～50 V。

定量分析：有标准品的用标准品定量分析，无标准品的黄酮类物质以芦丁计，花青素类以矢车菊-3-O-半乳糖苷计；原花青素类以表儿茶素计。类黄酮化合物含量以鲜果（fresh weight，FW）计，单位为μg·g1，每次测定包含3次生物学重复，检测条件如表1。

表1 山楂果实中类黄酮物质UPLC-MS/MS-ESI检测条件Table 1 UPLC-MS/MS-ESI of hawthorn fruit flavonoids compounds

1.3 数据分析

利用SPSS v20.0 软件Duncan's Multiple Range Test（DMRT）法对测定的数据进行方差分析。采用SVD（Singular Value Decomposition）法基于MetaboAnalyst v5.0软件进行主成分分析、OPLS 分析及聚类分析，并进行可视化作图。

2 结果与分析

2.1 黑色与红色毛山楂果皮颜色分析

毛山楂果实成熟时果皮通常为红色。黑色毛山楂为毛山楂中选出的实生后代，其成熟果实的果皮为黑色。利用色差仪测定了黑色与红色毛山楂果实的L*、a*、b*值，并计算C*和h°值。结果显示（表2），红色毛山楂果实亮度L*值显著高于黑色毛山楂；色相a*值和b*值也显著高于黑色毛山楂。黑色毛山楂果实整体呈现为近黑色；红色毛山楂果实则为深红色。

表2 黑色与红色毛山楂果实色差值差异Table 2 Difference of chromatism indexes between black and red hawthorn fruit

2.2 黑色与红色毛山楂果实类黄酮化合物的差异分析

利用超高效液相色谱串联飞行时间质谱联用仪从黑色与红色毛山楂果实中共鉴定出21种黄酮/苯丙素类化合物（图2），包括山楂果实中常见的芦丁、金丝桃苷、异槲皮素、原花青素、表儿茶素、绿原酸等化合物。此外，还鉴定出3 种花青素类化合物，包含2 种山楂共有的矢车菊-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-阿拉伯糖苷/木糖苷，及黑色毛山楂中特有的矢车菊-3-O-葡萄糖苷，其保留时间分别为5.01，5.45，5.19 min（图3）。以上结果说明，黑色与红色毛山楂中类黄酮化合物的种类非常丰富，2 种山楂资源所含类黄酮化合物的种类基本相似，黑色毛山楂果实中特有花青素类化合物矢车菊-3-O-葡萄糖苷。

图2 黑色与红色毛山楂果实280 nm色谱图（黄酮/苯丙素类）Figure 2 280 nm chromatogram of black and red hawthorn fruits (flavonoids/phenylpropanoids)

图3 黑色与红色毛山楂果实520 nm色谱图（花青素类）Figure 3 520 nm chromatogram of black and red hawthorn fruits (Anthocyanins)

2.2.1 黑色与红色毛山楂果实黄酮类化合物的含量差异 黄酮类化合物是山楂主要的功效成分之一。超高效液相色谱串联飞行时间质谱联用仪分析结果显示，2种毛山楂果实中共包含出6种黄酮类化合物，包括芦丁、金丝桃苷、牡荆素异构体、异槲皮素、芹菜素-O-葡萄糖苷和槲皮素-O-(-O-丙二酰基)-葡萄糖（表3）。黑色毛山楂果实中芦丁、金丝桃苷、异槲皮素、芹菜素-O-葡萄糖苷和槲皮素-O-(-O-丙二酰基)-葡萄糖的含量均显著高于红色毛山楂（表3），其中金丝桃苷含量最高（901.96 μg·g-1），是红色毛山楂的1.63倍；芦丁含量是红色毛山楂的2.17倍；异槲皮素含量是红色毛山楂的3.16倍；芹菜素-O-葡萄糖苷含量是红色毛山楂的3.26倍；槲皮素-O-(-O-丙二酰基)-葡萄糖含量是红色毛山楂的2.78倍。

表3 黑色与红色毛山楂果实黄酮类化合物含量差异Table 3 Differences in flavonol compounds content between black and red hawthorn fruits

2.2.2 黑色与红色毛山楂果实原花青素类化合物的含量差异 山楂果实中的类黄酮物质，主要以原花青素为主。2种毛山楂果实中共鉴定出7种原花青素类化合物（表4），包括原花青素B1、儿茶素、原花青素B2/B4/B5、表儿茶素、原花青素三聚体、原花青素四聚体和原花青素五聚体。红色毛山楂果实中原花青素B1、原花青素B2/B4/B5、表儿茶素、原花青素三聚体、原花青素四聚体和原花青素五聚体的含量均显著高于黑色毛山楂（表4），其中表儿茶素含量最高（12 844.31 μg·g-1），是黑色毛山楂的1.29倍；原花青素B1含量是黑色毛山楂的3.20倍；原花青素B2/B4/B5含量是黑色毛山楂的1.38倍；原花青素三聚体含量是黑色毛山楂的1.62倍；原花青素四聚体含量是黑色毛山楂的1.55倍；原花青素五聚体含量是黑色毛山楂的1.51倍。黑色毛山楂果实儿茶素的含量（137.79 μg·g-1）是红色毛山楂的1.38倍。

表4 黑色与红色毛山楂果实原花青素类化合物含量差异Table 4 Differences in proanthocyanidin compounds content between black and red hawthorn fruits

2.2.3 黑色与红色毛山楂果实酚酸和花青素类化合物的含量差异 2种毛山楂果实中共鉴定出2种酚酸，3种花青素类化合物（表5），包括新绿原酸、绿原酸、矢车菊-3-O-半乳糖苷、矢车菊-3-O-葡萄糖苷和矢车菊-阿拉伯糖苷/木糖苷。黑色毛山楂果实新绿原酸的含量（256.38 μg·g-1）为红色毛山楂的50.54倍，绿原酸的含量（245.98 μg·g-1）则为红色毛山楂的0.59倍。花青素类化合物方面，黑色毛山楂中3种花青苷含量均显著高于红色毛山楂，其中矢车菊-3-O-半乳糖苷含量（1 323.66 μg·g-1）是红色毛山楂的1.59倍，矢车菊-阿拉伯糖苷/木糖苷含量（731.43 μg·g-1）是红色毛山楂的7.97倍。特别是呈现红色的矢车菊-3-O-葡萄糖苷，在黑色毛山楂果实中大量积累（3149.17 μg·g-1），而在红色毛山楂果实中并未检测到。这3种花青苷物质的含量差异可能是黑色与红色毛山楂果实颜色差异的主要原因。

表5 黑色与红色毛山楂果实酚酸及花青素类化合物含量差异Table 5 Differences in phenolic acid and anthocyanin compounds between black and red hawthorn fruits

2.3 黑色与红色毛山楂果实类黄酮化合物含量的主成分分析

为解析黑色与红色毛山楂成熟果实中类黄酮物质成分及含量的差异，对这两组样品进行主成分分析（principal component analysis，PCA）分析。图4A 为PCA 散点图，数据经降维处理后，获得PC1=97.7%，PC2=1.5%，累积达99.2%，说明变量的第一和第二主成分在山楂果实类黄酮化合物含量具有极高代表性。图4B为PCA 结果载荷图，结果显示黑色毛山楂与矢车菊-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-阿拉伯糖苷/木糖苷、儿茶素、芦丁、金丝桃苷、异槲皮素和芹菜素-O-葡萄糖苷在PC1上呈正相关关系；红色毛山楂与表儿茶素、原花青素三聚体、原花青素四聚体、原花青素五聚体、原花青素B2/B4/B5和牡荆素异构体在PC2上呈正相关关系。基于载荷图（Loading plot，图4B）可以筛选出分类贡献较大的变量，横坐标方向上远离原点的变量对两组样本的区分贡献更大（矢车菊-3-O-葡萄糖苷、新绿原酸）。

图4 黑色与红色毛山楂类黄酮化合物PCA散点图（A）和载荷图（B）Figure 4 PCA scatter plot (A) and load plot (B) of flavonoid compounds in black and red hawthorn

OPLS-DA 分析是以变量的重要性为主要依据，从而对代谢物质进行选择和甄别，更能把握多维数据整体的特征以及变异规律。模型验证Permutations Test图显示（图5B），R2Y=0.994，Q2=0.983。这些模型参数指数均大于0.5且接近于1，符合试验数据模型的预期，说明建立的OPLS-DA 模型可以有效地揭示黑色与红色毛山楂果实中类黄酮化合物的差异。

图5 黑色与红色毛山楂类黄酮物质OPLS-DA图（A）和模型检验图（B）Figure 5 OPLS-DA plots (A) and permutations test (B) of flavonoid compounds in black and red hawthorn

3 讨论与结论

山楂重要的功效成分为类黄酮化合物，其主要成分为牡荆素鼠李糖苷、单乙酰牡荆素鼠李糖苷以及金丝桃苷等物质[19]。前期相关研究通过测定东北三省不同来源地的野生山楂资源果实发现，其黄酮类物质芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量分别为6.8～217.5，159.6～1312.9，6.2～132.6 μg·g-1[20]。白婧[21]研究结果显示，磨盘等10份辽宁山楂主栽品种果实中，芦丁含量为3.32 μg·g-1（蒙阴大金星）至51.76 μg·g-1（大黄）；牡荆素含量为17.55 μg·g-1（蒙阴大金星）至364.79 μg·g-1（大黄）；金丝桃苷含量为209.0 μg·g-1（蒙阴大金星）至684.24 μg·g-1（大黄）；槲皮素含量为1.14 μg·g-1（辽红）至3.56 μg·g-1（秋金星）。本研究中，黑色毛山楂果实富含芦丁（27.11 μg·g-1）、金丝桃苷（901.96 μg·g-1）和异槲皮素（55.25 μg·g-1）；红色毛山楂果实牡荆素异构体含量相对较高（72.47 μg·g-1）（表3）。黑色与红色毛山楂果实金丝桃苷的含量均显著高于部分山楂栽培品种，但低于部分野生山楂资源。此外，本研究在黑色和红色毛山楂果实中，还测定出了芹菜素-O-葡萄糖苷和槲皮素-O-(-O-丙二酰基)-葡萄糖这两种黄酮类化合物。

原花青素，特别是低聚原花青素（oligomeric proanthocyanidins）是山楂果实的主要酚类物质[22]。羽裂山楂大果变种干燥果实中，以表儿茶素和原花青素B2为主，其含量分别为1 930 μg·g-1（大金星）至11 700 μg·g-1（山东大金星），20 600 μg·g-1（大金星）至123 600 μg·g-1（山东大金星）[23]。本研究中，黑色毛山楂鲜果表儿茶素含量为9 990.65 μg·g-1，红色毛山楂鲜果中含量达12 844.31 μg·g-1（表4），两份毛山楂均属于原花青素含量较高的山楂资源。

花色苷是影响园艺植物果实颜色的主要类黄酮物质之一。国内的栽培山楂果实主要以红色、橙色或黄色为主。蒙阴大金星等10个辽宁主栽品种果实中主要含矢车菊-3-O-半乳糖苷和矢车菊-3-O-阿拉伯糖苷，其中矢车菊-3-O-半乳糖苷含量在110.51 μg·g-1（费县大绵球）至1 101.97 μg·g-1（兴隆紫肉）；矢车菊-3-O-阿拉伯糖苷含量在3.52 μg·g-1（磨盘山楂）至22.43 μg·g-1（兴隆紫肉）[21]。本研究中，黑色毛山楂果实的矢车菊-3-O-半乳糖苷（1 323.66 μg·g-1）含量是红色毛山楂的1.59 倍（表5），亦是山楂栽培品种兴隆紫肉的1.21 倍，属于花青素含量较高的山楂资源。

此外，矢车菊-3-O-葡萄糖苷是接骨木莓果、黑莓、桑椹、杨梅等园艺植物果实花青苷的主要成分，其中台湾46C 桑葚鲜果含量达1 337 μg·g-1；黑莓鲜果含量达1 387.2 μg·g-1；接骨木莓果鲜果中的含量可达7 941.3 μg·g-1[24-26]。本研究中，红色毛山楂未检测到矢车菊-3-O-葡萄糖，黑色毛山楂果实矢车菊-3-O-葡萄糖苷含量高达3 149.17 μg·g-1。因此，富含矢车菊-3-O-半乳糖苷和矢车菊-3-O-葡萄糖苷的黑色毛山楂可为提升山楂果实品质奠定资源基础。

本研究通过测定黑色与红色毛山楂果实色差值，并结合超高效液相色谱质谱技术检测两种山楂资源果实类黄酮化合物的含量差异，结果显示黑色毛山楂中芦丁、金丝桃苷等黄酮类化合物，矢车菊-3-O-半乳糖苷等花青素类化合物含量较高，且仅在黑色毛山楂果实中鉴定出大量的矢车菊-3-O-葡萄糖苷。研究结果将为山楂果实颜色及品质的改良提供参考依据。