电针促进应激性溃疡小鼠胃黏膜损伤修复的实验研究

高 浩，雍 玥，吴晓珲，陈文婷

1.上海中医药大学附属曙光医院麻醉科（上海 201203）；2.上海中医药大学附属曙光医院针麻研究所（上海 201203）

针刺作为中医学的重要治疗方法，已经普遍被国际主流医学界所认可和接纳，并广泛应用于临床各种疾病的预防和治疗。其中，电针在调理胃肠功能、促进胃动力恢复、治疗胃肠损伤等方面具有显著疗效［1-3］。

前期研究［4］证实，电针足三里穴、梁丘穴可显著提高腹腔镜手术患者围术期胃黏膜血流量，抑制胃黏膜酸化，提示电针具有胃黏膜保护效应。动物实验［5-6］也证实，电针“足三里”穴可以抑制乙醇或非甾体抗炎药引起的大鼠应激性溃疡，提高胃黏膜血流量，促进胃黏膜修复，这与临床研究结果一致。在基础研究领域，已有研究［7-9］证实针刺治疗应激性溃疡可能与一些修复因子的释放有关。此外，低氧诱导因子-1α（HIF-1α）对缺血及损伤的胃黏膜具有修复作用［10］。但是，电针是否能够有效提高修复因子释放及HIF-1α 表达，从而促进胃黏膜损伤修复，仍缺乏相关研究证实。本研究旨在观察电针对促进应激性溃疡小鼠胃黏膜损伤修复的影响，探讨电针的修复作用与促进修复因子释放及上调HIF-1α表达水平的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性SPF 级C57BL/6 小鼠27 只，体质量22～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。小鼠饲养于上海中医药大学实验动物中心。动物使用许可证号：SYXK（沪）2020-0009。小鼠自由摄食和饮水，控制饲养温度（21 ℃）和光照时间（上午7：00 至晚上21：00）在稳定的条件下。动物实验方案经上海中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理批准号：2019-0014）。

1.1.2 药物与试剂 异氟烷，江苏恒瑞医药有限公司（批号：S190815）；磷酸化蛋白酶抑制剂，武汉赛维尔生物科技有限公司（批号：G2007）；二喹啉甲酸比色法（BCA）蛋白定量检测试剂盒，武汉赛维尔生物科技有限公司（批号：G2026）；抗小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体 ，武汉赛维尔生物科技有限公司（批号：GB12002）；抗小鼠HIF-1α 抗体，武汉赛维尔生物科技有限公司（批号：GB14165）；RNA 酶抑制剂，美国Invitrogen 公司（批号：c10777000）；cDNA 反转录试剂盒（First Strand cDNA synthesis Kit），美国Invitrogen 公司（批号：K1622）；实时荧光定量PCR 试剂盒（QuantityNova SYBR Green PCR Kit），德国QIAGEN 公司（批号：208052）；cDNA 反转录随机引物，美国Invitrogen公司（批号：17504044）。

1.1.3 主要仪器 电子天平，德国Sartorius公司（型号：SecuraSQP）；电针仪，苏州医疗用品厂有限公司（型号：SDZ-ⅡB）；一次性无菌针灸针（规格：0.16 mm×7 mm），苏州天协针灸器械有限公司；动物麻醉机，上海玉研科技仪器有限公司（型号：ABS-100）；梯度PCR 仪，美国Thermo Fisher Scitific 公司（型号：Veriti DX）；荧光定量PCR 仪，瑞士Roche 公司（型号：Roche 480Ⅱ Real Time PCR System）；凝胶成像系统，上海天能科技有限公司。

1.2 造模 采用冷束缚应激（cold restraint stress，CRS）建立小鼠应激性溃疡模型，参照既往已形成的稳定的CRS 小鼠模型建立方法［11-12］。小鼠以2%～3%的异氟烷吸入麻醉，至小鼠昏睡、呼吸平稳，镊子轻夹胡须及身体无体动，停止吸入异氟烷。将昏睡小鼠上肢和下肢分别用胶布缠绕固定，然后放入自制的塑料固定器中，露出头端及尾部，供小鼠正常呼吸（见图1）。整个固定过程约5 min，小鼠在此过程中始终处于昏睡状态，便于操作固定和减少应激反应。随后将小鼠连同固定器放于4 ℃冰箱，关闭箱门，45 min后取出并松绑。按此方法连续CRS造模3 d，每日2次，上、下午各1次。CRS 小鼠应激性溃疡模型稳定性检测：造模3 d后，小鼠呈现安静、萎靡不振、身体蜷缩、寒战等状态，为造模成功的行为学标准；体视镜下可见胃黏膜充血、水肿、全胃散在多发点状/片状糜烂及出血，胃黏膜溃疡指数（UI）评分5分以上，为造模成功的形态学标准。

图1 小鼠束缚后放入自创固定装置

1.3 分组与干预 在实验前16～20 h，小鼠禁止摄入食物，但可以自由饮水。将小鼠按体质量随机分成对照组（Sham 组）、模型组（CRS 组）及模型+电针组（CRS+EA组），每组9只。

3 组小鼠干预方法如下。①Sham 组：不进行冷束缚应激的造模和电针干预，其他与③相同；②CRS 组：不进行电针干预，其他操作与③相同；③CRS+EA 组：建立CRS 的小鼠应激性溃疡模型，造模3 d 后进行电针干预。

小鼠针灸穴位的定位标准均参考《实验针灸学》［13］。①“足三里”穴（ST36）：膝关节下外侧，腓骨小头下3.5 mm 处。②“梁丘”穴（ST34）：在膝关节上外方2 mm 处，股直肌和股外侧肌之间，与外膝眼在一条直线上（见图2）。自造模第4 天开始，用自制硅胶束缚器对小鼠进行束缚，暴露小鼠后肢。在小鼠清醒状态下用0.16 mm×7 mm（直径×长度）针灸针斜刺入小鼠两侧“足三里”穴和“梁丘”穴，“足三里”穴接正极，“梁丘”穴接负极。将电针仪金属夹子夹于针灸针针尾，参数设置为连续波型，电流脉冲频率2 Hz，刺激强度0.5 mA，刺激时间为15 min，上、下午各1次，持续2 d。

图2 鼠科动物“足三里”穴（ST36）、“梁丘”穴（ST34）与尾部非经穴图解［13］

实验开始后第6 天取材。每组中3 只用于蛋白质免疫印迹（Western blot）及实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测，6只用于UI评分。小鼠吸入2%～3%的异氟烷麻醉气体，3～5 min后呈现麻醉状态（镊子夹起胡须无反应），置于操作台，迅速备皮，外科镊夹住皮肤轻提，外科剪沿正中线剪开腹部皮肤，钝性分离皮下、脂肪及肌肉组织，向上翻开大网膜，游离胃组织，沿胃体向上分离胃贲门部，并用缝线结扎，同样沿胃体向下探寻至胃幽门部并结扎。用一次性针筒斜刺入胃体内并注射4%中性甲醛溶液2 mL，两端结扎线向外上提起，顺势摘下小鼠全胃，浸没在20 mL 的4%中性甲醛溶液中，固定大约30 min。轻提结扎线，沿着小鼠胃大弯侧全层剖开，暴露胃体内部，在操作板上展开全胃组织，头针作周边固定，用质量分数为0.9%的氯化钠溶液清洗胃内容物。观察胃黏膜的形态学变化，可见胃黏膜呈现多发的点状出血或数个溃疡灶。UI评分5 分以上为造模成功的形态学标准。体视镜下可见胃黏膜充血、水肿，全胃散在多发点状/片状糜烂及出血或多个溃疡点，溃疡基底部可见白色或黄白色厚苔，其中个别溃疡点可深达肌层甚至穿孔（见图3）。

图3 小鼠造模3 d后胃黏膜形态学变化

1.4 检测指标与方法 电针治疗结束后取小鼠全胃，评估UI评分以及检测修复因子［三叶因子2（TFF2）、血管内皮生长因子（VEGF）、热休克蛋白70（HSP70）］和调控因子HIF-1α表达水平。

1.4.1 胃黏膜损伤修复的检测指标（UI评分） 电针治疗结束后取材小鼠全胃，评估UI 评分。UI 评分：参照GUTH法［11］计算，全胃中各糜烂、出血点、溃疡灶等的长度所对应的分值相加之和。0 分：无损伤；1 分：1 mm以内的损伤（包括糜烂点）；2 分：2～4 mm 的损伤；3 分：≥4 mm的损伤；损伤宽度>2 mm者分值加倍。

1.4.2 胃黏膜组织修复因子（TFF2、VEGF、HSP70）和调控因子HIF-1α的mRNA 表达 采用RT-qPCR 法检测胃组织TFF2、VEGF、HSP70及HIF-1αmRNA 表达水平，取-80 ℃冻存的大鼠胃组织，以TRIzol 法提取结肠组织总RNA ，逆转录反应体系为20 μL ，根据试剂说明书操作，按条件进行逆转录。反应条件：40 ℃，30～60 min；95 ℃，5 min。扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。PCR 反应条件：95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，40 个循环。采用Melt 曲线分析，以GAPDH 的表达为内参，每个样品重复3 次，扩增结束，记录Ct 值，按照2-ΔΔCt公式计算目的基因mRNA的相对表达量。

表1 引物序列

1.4.3 HIF-1α 的蛋白表达水平 采用Western blot 法检测胃组织中HIF-1α 蛋白表达。取全胃组织，用冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤去污，切块置于匀浆器；加入组织后在-20 ℃冰上彻底匀浆，将匀浆液振荡；加入RIPA裂解液，冷浴20 min，然后反复吹打，确保细胞完全裂解；12 000 r/min 离心10 min，收集上清为总蛋白溶液；再用BCA 测蛋白浓度；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）处理45 min。转膜：准备滤纸和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，在垫子上垫海绵、两层滤纸，并除气泡、打湿，25 V恒压转膜过夜。免疫反应：5%的脱脂牛奶封闭1 h，4 ℃孵育一抗3 h，脱色摇床上洗3 次，每次5 min；孵育二抗，30 min，脱色摇床上洗3 次，每次5 min。化学发光：进行显影和定影，根据不同的光强度调整曝光条件，凝胶图像分析；胶片扫描，存档，整理去色，Alpha 软件处理条带光密度值；以β-actin 作为内参蛋白，重复3次。

1.5 统计学方法 实验数据采用SPSS 1.0 软件进行统计分析。计量资料以±s表示。所有数据进行正态性检验，符合正态分布者，多组计量资料之间比较采用单因素方差分析，方差齐者用LSD 和SNK 法，方差不齐者用Tamhane's T2 或Dunnett's T3 法；不符合正态分布者采用多组资料的秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对UI评分的影响 与Sham 组比较，CRS 组、CRS+EA 组UI 评分显著升高（P<0.05）。与CRS 组比较，CRS+EA 组UI 评分显著下降（P<0.05）。上述说明电针治疗可以促进胃黏膜损伤后的修复，减轻胃黏膜损伤。见表2、图4。

表2 各组小鼠胃黏膜UI评分比较（n=6，±s，分）

表2 各组小鼠胃黏膜UI评分比较（n=6，±s，分）

注：Sham组为对照组，CRS组为模型组，CRS+EA组为模型+电针组。UI为溃疡指数。与Sham组比较，*P<0.05；与CRS组比较，#P<0.05。

UI评分0.67±0.33 43.50±18.01*16.33±5.20*#组别Sham组CRS组CRS+EA组

图4 各组小鼠胃黏膜的形态学变化

2.2 对TFF2、VEGF、HSP70mRNA 表达的影响 与Sham 组比较，CRS 组VEGF、HSP70mRNA 显著升高（P<0.05），CRS 组TFF2 差异无统计学意义（P>0.05），CRS+EA 组TFF2、VEGF、HSP70mRNA 显著升高（P<0.05）。与CRS 组比较，CRS+EA 组TFF2、VEGF、HSP70mRNA 显著升高（P<0.05）。上述说明电针治疗可以促进修复因子TFF2、VEGF、HSP70mRNA 分泌，可能与电针增强胃黏膜损伤后的修复能力有关。见表3。

表3 各组小鼠胃组织TFF2、VEGF、HSP70 mRNA的表达水平比较（2-ΔΔCt）（n=3，±s）

表3 各组小鼠胃组织TFF2、VEGF、HSP70 mRNA的表达水平比较（2-ΔΔCt）（n=3，±s）

注：TFF2 为三叶因子2 基因，VEGF 为血管内皮生长因子基因，HSP70为热休克蛋白70 基因。Sham 组为对照组，CRS 组为模型组，CRS+EA 组为模型+电针组。与Sham组比较，*P<0.05；与CRS组比较，#P<0.05。

HSP70 0.97±0.19 2.28±0.45*3.90±0.82*#组别Sham组CRS组CRS+EA组TFF2 1.21±0.82 2.08±0.74 5.23±1.39*#VEGF 1.03±0.27 2.33±0.52*3.55±0.68*#

2.3 对HIF-1αmRNA 及蛋白表达的影响 与Sham 组比较，CRS 组HIF-1αmRNA 及蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），CRS+EA 组HIF-1αmRNA 及蛋白表达显著升高（P<0.05）。与CRS组比较，CRS+EA组HIF-1αmRNA 及蛋白表达显著升高（P<0.05）。上述说明电针能够上调HIF-1α mRNA 及蛋白表达水平，增强胃黏膜损伤的修复。见表4、图5。

表4 各组小鼠胃组织HIF-1α mRNA 及蛋白的表达水平（n=3，±s）

表4 各组小鼠胃组织HIF-1α mRNA 及蛋白的表达水平（n=3，±s）

注：HIF-1α 为低氧诱导因子-1α。Sham 组为对照组，CRS组为模型组，CRS+EA 组为模型+电针组。与Sham 组比较，*P<0.05；与CRS 组比较，#P<0.05。

HIF-1α 蛋白1.00±0.01 1.52±0.27 4.07±0.48*#组别Sham组CRS组CRS+EA组HIF-1α mRNA 1.01±0.11 1.72±0.86 5.98±1.28*#

图5 各组小鼠胃组织HIF-1a蛋白电泳条带

3 讨论

创伤患者、重症颅脑疾病患者将面临应激性溃疡出血的风险，导致血流动力学剧烈波动，在重症监护室停留时间延长以及死亡风险增加［14-15］，探索其发病机制并寻找安全有效的防治方法具有重要的临床意义。针灸可通过调节体内神经-内分泌-免疫系统功能，从而温热脾胃、调和阴阳、预防脾胃病，其被广泛应用于临床治疗胃黏膜病变，但相关的作用机制有待进一步论证［16］。本研究通过CRS 的方法建立应激性溃疡小鼠模型，并采用电针治疗。结果显示，模型组小鼠胃黏膜充血、水肿，全胃散在多发点状/片状糜烂及出血，溃疡基底部可见白色或黄白色厚苔，个别溃疡点可深达肌层甚至穿孔，UI 评分显著升高，提示模型建立成功；而CRS+EA 组UI 评分显著降低。在明确证实针刺有效的前提下，我们采用分子生物学手段进一步证实了针刺的作用机制与促进修复因子的释放以及HIF-1α的表达升高有关。

3.1 选穴的理论与临床依据 足三里穴是足阳明胃经的合穴，它又是胃的下合穴，治疗胃痛、呕吐、腹胀、泄泻、便秘等胃肠系统疾病有明确的疗效。《灵枢·四时气》记载：“胃气逆则呕苦……取三里以下胃气。”明代徐凤所著《针灸大全》记载足三里穴“善治胃中寒”，而高度总结和概括该穴位主治作用的是《四总穴歌》中所述“肚腹三里留”。现代实验研究［17］证明，针刺足三里穴具有调节肠蠕动、提高多种消化酶活性、改善胃肠黏膜血流等作用，在防治胃病方面具有重要性、特异性、广泛性的特点。临床实践证明，针刺足三里穴治疗胃肠疾病有明显疗效。动物实验［18-19］亦证实针刺足三里穴对胃黏膜具有保护作用。足阳明胃经的郄穴是梁丘，它的主治功效主要集中在调整胃肠道蠕动功能方面。研究［20］证实，针刺梁丘穴对于胃肠道具有双向调节作用［1］。基于上述临床研究和动物实验基础研究，结合中医古代文献为理论依据，本研究从中医最常用的治疗胃病穴位——足三里穴、梁丘穴为切入点，进行基础实验研究，以进一步阐明电针对应激性溃疡胃黏膜修复作用的相关机制。

3.2 修复因子参与胃黏膜损伤修复 有研究［7-9］认为，针刺、艾灸、经皮穴位电刺激可通过增加相关修复因子的释放，促进应激性溃疡损伤的修复。修复因子VEGF可调控黏膜血管的生成，促进胃溃疡损伤后的修复［21］。组织因子（TFFs）又称为三叶因子家族，分为TFF1、TFF2 和TFF3。其中，TFF2 通常由黏液分泌细胞表达于小肠和大肠，可保护胃肠内分泌的多种酸性物质和蛋白酶不被降解，并促进损伤后黏膜的重建，它是损伤后的快速反应肽［22-23］。热休克蛋白（HSPs）是一种普遍存在且高度守恒的蛋白家族，能够形成一种特殊机制来防止各种环境压力和不利条件对细胞结构的破坏，其主要功能是保护细胞、对抗压力，维持细胞正常生理机能，增加细胞对刺激的防御和适应能力［24］。本研究结果显示，电针可减轻应激性溃疡模型小鼠的胃黏膜损伤，并促进修复因子TFF2、VEGF、HSP70表达水平显著升高。上述说明电针干预的有效性主要体现在促进修复因子释放，进而增强胃黏膜损伤后的修复能力。

3.3 HIF-1α 参与胃黏膜损伤修复 研究［25］发现，一种控制基因表达的细胞氧感应系统广泛存在于多种病理环境之中，HIF-1α 被确定为低氧转录反应的主要调节因子，在氧浓度正常的条件下，HIF-1α通过氧敏性HIF-1α 特异性脯氨酰羟化酶（PHD1、PHD2、PHD3）发生羟基化。当氧浓度降低时，HIF-1α将不被羟基化，在细胞核中积累，并与HIF-1β 结合，形成HIF-1 复合体，该复合体在转录上变得活跃。在应激性溃疡胃黏膜损伤的状态下，胃黏膜组织局部处于缺血、低氧的状态，氧浓度下降使HIF-1α蛋白稳定性增加，诱导内皮细胞分化，促进血管重建及改善缺血，进而增强胃黏膜损伤后的修复作用［10］。研究［26］显示，小鼠皮肤和黏膜损伤后的局部缺血、低氧性改变，可促进HIF-1α 蛋白稳定，激活体液因子的分泌与表达，其中最为显著的是VEGF。此外，Tsuchida 等［27］证实，将家兔的软骨细胞置于低氧环境中，可通过刺激HIF-1α 的大量生成，诱导HSP70 的高度表达，进而促进细胞生成、减少凋亡。本研究结果显示，通过电针干预模型小鼠，可减轻其胃黏膜损伤，显著降低UI评分，显著升高HIF-1α 表达。上述说明电针对HIF-1α 具有一定的调控作用，电针干预可能通过上调HIF-1α 的表达水平，增强应激性溃疡后胃黏膜损伤的修复作用。

3.4 小结 本研究证实，电针促进应激性溃疡胃黏膜损伤的修复能力与HIF-1α 的上调、以及修复因子（TFF2、VEGF、HSP70）的表达增强有关，但这种相关性是否具有因果关系，抑或电针是如何通过上游调控机制来上调HIF-1α的表达，促进修复因子的释放，增强应激性溃疡胃黏膜损伤修复，这些尚有待进一步的基础研究来证实。

综上所述，电针治疗可以促进应激性溃疡小鼠修复因子的释放，促进胃黏膜损伤后的修复，显著上调HIF-1α表达水平。本研究结果有助于推动电针应用于应激性溃疡的临床治疗，并为进一步优化针刺对低氧诱导因子为关键调控靶点的电针穴位治疗提供科学依据。