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复方苦参汤对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中炎症因子及自噬水平的影响

2023-09-08邓双娇左冬梅陈倩云刘与进李华蓉

上海中医药杂志 2023年9期
关键词:苦参沙拉结肠

邓双娇,左冬梅,陈倩云,刘与进,李华蓉,2

华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科(湖北 武汉 430022);2.华中科技大学协和京山医院中医科(湖北 荆门 431800)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种累及结肠黏膜的慢性非特异性炎症性疾病,临床主要表现为持续或反复发作的腹泻、黏液脓血便伴腹痛、里急后重等[1]。我国UC 的发病率呈明显上升的趋势[2]。UC复发率高,迁延难愈,且有一定的癌变率,被世界卫生组织列为世界难治性疾病。因此积极探索UC 的发病机制和治疗方法具有重要的临床意义。

自噬对炎症反应有重要的调控作用,不仅影响感染性疾病的缓解和炎症性疾病的病理过程,而且在无细菌感染的组织损伤诱发的炎症反应中也能发挥抗炎效应。自噬功能障碍是UC发病的重要因素[3-4],因此调控自噬可能是控制UC肠道炎症的切入点之一。

复方苦参汤治疗UC临床疗效确切[5-7],然相关的作用机制需要进一步探究。本研究通过观察UC 小鼠结肠组织自噬相关分子及炎症因子表达情况,探讨复方苦参汤治疗UC 的可能机制,以期为本病的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF 级7~8 周龄的雄性C57BL/6 小鼠20只,体质量18~22 g,由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供。动物生产合格证号:SCXK(J)2019-0010。实验动物饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心。动物使用许可证号:SYXK(鄂)2016-0057。采光昼夜交替,普通饲料喂养,自由饮水。本实验方案经华中科技大学同济医学院实验动物伦理委员会审核批准(伦理批准号:S2640)。

1.1.2 药物与试剂 复方苦参汤由苦参15 g、地榆15 g、青黛3 g、白及10 g、三七3 g、甘草10 g 组成,购自华中科技大学同济医学院附属协和医院中药房。上述中药煎煮浓缩至100 mL含生药量36.4 g水溶液,于4 ℃条件下保存备用。

美沙拉嗪缓释颗粒(0.5 g/粒),法国爱的发制药集团(批号:H20193164)。使用前采用质量分数为0.9%的氯化钠溶液配成5 g/L混悬液。

葡聚糖硫酸钠(DSS),美国MP Biomedicals 公司(批号:Q7418);Bcl-2 同源结构域蛋白1(Beclin1)、泛素结合蛋白 P62(P62)、微管相关蛋白1A/1B 轻链3(LC3)、β-肌动蛋白(β-actin)、一抗及羊抗兔HRP 标记二抗,武汉爱博泰克生物科技有限公司(批号分别为A7353、A7758、A19665、AC026、AS014);小鼠白介素(IL)-1β、IL-4、IL-10、IL-18 试剂盒,蛋白裂解液、二奎啉甲酸法(BCA)定量试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒、增强型化学发光试剂盒(ECL)、4%多聚甲醛固定液,上海碧云天生物技术有限公司(批号分别为PI301、PI612、PI522、PI553、P0013B、P0012S、P0012A、P0018S、P0099);RNA 逆转录试剂盒、实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测试剂盒,南京诺唯赞生物科技股份有限公司(批号分别为R212-01/02、Q411-02/03);隐血试剂盒,南京建成生物工程研究所(批号:C027-1-1)。

1.1.3 主要仪器 蛋白电泳仪,北京市六一仪器厂(型号:DYY-6C);转膜仪,北京市六一仪器厂(型号:DYCZ-400D);StepOne Plus 实时荧光定量PCR 仪,美国ABI 公司(型号:7500);核酸测定仪,美国Thermo Fisher Scientific 公司(型号:NanoDrop ONE);化学发光仪,美国Thermo Fisher Scientific 公司(型号:iBright750);研磨仪,武汉赛维尔生物科技有限公司(型号:KZ-Ⅱ);酶标仪,美谷分子仪器(上海)有限公司(型号:CMax Plus);台式离心机,德国Eppendorf 公司(型号:5424R);数码显微镜,日本Olympus 株式会社(型号:DP73);电子天平,杭州万特衡器有限公司(型号:WT2002)。

1.2 分组与造模 20 只C57BL/6 小鼠适应性喂养7 d后,随机分为正常组、模型组、复方苦参汤组及美沙拉嗪组,每组5 只。除正常组外,其余组别小鼠应用3%DSS溶液诱导7 d,建立UC模型,小鼠出现腹泻、体质量减轻、黏液脓血便时说明造模成功[8]。

1.3 干预方法 造模的同时开始灌胃给药,在造模第1 天起,按10 mL/kg 体质量,正常组和模型组以质量分数为0.9%的氯化钠溶液灌胃,复方苦参汤组予复方苦参汤浓缩液7.28 g/kg 灌胃,美沙拉嗪组予美沙拉嗪混悬液0.52 g/kg 灌胃,每日1 次,连续给药7 d。同时每日观察并记录各组小鼠体质量变化、大便性状及隐血情况,计算疾病活动指数(DAI)评分。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 一般情况及DAI 评分 造模及灌胃期间,每日观察并记录小鼠的活动度、体质量及大便性状、隐血等一般情况。根据评分标准[9]进行评分。DAI 评分=(体质量下降评分+大便性状评分+大便隐血评分)/3。分数越高,提示炎症越重。评分标准详见表1。

表1 疾病活动指数(DAI)评分标准

1.4.2 结肠长度、形态变化情况 小鼠麻醉后解剖,取小鼠盲肠至肛门端并平铺于白纸上,使用手机相机原像素拍照并记录。

1.4.3 结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分及苏木精-伊红(HE)染色 分离结肠后,沿肠系膜纵轴剪开,用预冷的磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗后,用滤纸吸干,平放在白纸上进行CMDI评分[8]评价(评分标准见表2)。使用4%多聚甲醛固定小鼠结肠,石蜡包埋切片后,HE 染色,通过显微镜观察结肠组织病理变化情况。见表2。

1.4.4 结肠组织IL-1β、IL-4、IL-10、IL-18水平 小鼠结肠组织称重后,按1∶5 的质量体积比,加入预冷的PBS,使用匀浆机充分匀浆,5 000 r/min、4 ℃离心15 min,取上清液,严格按照ELISA 试剂盒说明书操作步骤检测炎症因子IL-1β、IL-4、IL-10、IL-18的水平。

1.4.5 结肠组织中P62、Beclin1、LC3 蛋白表达 采用免疫印迹(Western blot)法检测结肠组织中P62、Beclin1、LC3 蛋白表达水平。取适量小鼠结肠组织,加入蛋白裂解液及3 颗匀浆珠,进行低温匀浆(60 Hz,180 s);冰上裂解20 min 后,4 ℃、12 000 r/min 离心10 min,吸取上清液至新的EP 管。采用二奎啉甲酸法(BCA)测定蛋白浓度,配制10%的丙烯酰胺分离胶,5%的浓缩胶,上样进行电泳。用0.45 μm 的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)转膜,5%的牛奶封闭1 h,三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBST)清洗3 次,每次5 min;分别加入Beclin1、LC3、P62、β-actin 抗体(1∶2 000),4 ℃孵育过夜;用TBST 洗膜后,二抗孵育1 h;洗膜,增强型化学发光液显影,曝光仪中曝光。利用ImageJ 软件对蛋白条带灰度值进行分析,以β-actin作为内参蛋白,以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值表示其相对表达量。

1.4.6 结肠组织中P62、Beclin1、LC3mRNA 的表达采用RT-qPCR 法检测结肠组织中P62、Beclin1、LC3mRNA的表达水平。TRIzol法提取结肠组织总RNA,测定浓度及纯度后,逆转录为cDNA,体系为20 μL、42 ℃、15 min。以β-actin为内参,利用实时荧光定量PCR 仪进行扩增,经高温变性(95 ℃,10 s)、退火(60 ℃,60 s)、延伸(60 ℃,30 s)、循环(40次),每个样品重复3次。扩增结束,记录Ct 值。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。引物序列见表3。

表3 引物序列

1.5 统计学方法 实验数据采用SPSS Statistics 24.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示,多组间比较使用单因素方差分析,组间比较采用LSD 检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对一般情况及DAI评分的影响 造模前各组小鼠反应灵活,精神状态良好,体质量基本相当,大便正常,隐血试验均为阴性。造模后,小鼠逐渐出现精神萎靡,体质量下降,出现肉眼黏液脓血便和稀水样黄便、黑便。复方苦参汤组部分小鼠出现黏性、较为成形的大便,血便明显减少,体质量缓慢恢复;美沙拉嗪组血便减少,但是部分仍腹泻,体质量逐渐恢复。正常组小鼠实验期间DAI评分为0分。与正常组比较,模型组小鼠DAI 评分明显升高(P<0.05);与模型组比较,复方苦参汤组及美沙拉嗪组DAI评分明显降低(P<0.05);与美沙拉嗪组比较,复方苦参汤组DAI 评分差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 各组小鼠DAI评分比较

2.2 对结肠长度及CMDI评分的影响 与正常组比较,模型组小鼠的结肠长度明显缩短(P<0.05),而结肠黏膜CMDI 评分显著升高(P<0.05)。与模型组比较,复方苦参汤组及美沙拉嗪组小鼠结肠长度明显增加(P<0.05),而结肠黏膜CMDI评分均明显降低(P<0.05)。与美沙拉嗪组比较,复方苦参汤组CMDI评分升高(P<0.05),而结肠长度差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 各组小鼠结肠长度及CMDI评分比较

2.3 对结肠组织形态的影响 正常组结肠黏膜表面光滑,形态完整,细胞排列整齐,无炎症细胞浸润。模型组结肠组织黏膜层可见灶性糜烂坏死,坏死区域黏膜内肠腺结构消失,伴有大量炎症细胞浸润(如红色箭头所示)。复方苦参汤组肠道黏膜层可见小灶性糜烂,部分肠腺结构损伤,伴有少量炎症细胞弥漫性浸润(如红色箭头所示)。美沙拉嗪组肠黏膜层肠腺结构清晰,排列规则,黏膜层局部有炎症细胞弥漫性浸润(如红色箭头所示)。见图3。

图3 各组小鼠结肠组织病理情况(HE染色,×100)

2.4 对结肠组织炎症因子IL-1β、IL-4、IL-10、IL-18 的影响 与正常组比较,模型组小鼠结肠组织中IL-1β、IL-18含量显著升高(P<0.05),IL-4、IL-10含量显著下降(P<0.05)。与模型组比较,复方苦参汤组和美沙拉嗪组小鼠结肠组织中IL-1β、IL-18 含量显著下降(P<0.05),而IL-4、IL-10含量显著增加(P<0.05)。与美沙拉嗪组比较,复方苦参汤组结肠组织中IL-1β、IL-18 含量升高(P<0.05),而IL-4、IL-10 含量下降(P<0.05)。见图4。

图4 各组小鼠结肠IL-1β、IL-18、IL-4、IL-10表达水平比较

2.5 对结肠组织自噬相关分子Beclin1、LC3、P62 蛋白和mRNA表达水平的影响 与正常组比较,模型组小鼠结肠组织中P62 蛋白和其mRNA 的表达水平明显升高(P<0.05),Beclin1、LC3 蛋白和其mRNA 的表达水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,复方苦参汤组及美沙拉嗪组P62 蛋白和其mRNA 的表达水平明显降低(P<0.05),而Beclin1、LC3 蛋白和其mRNA 表达水平明显升高(P<0.05)。与美沙拉嗪组比较,复方苦参汤组P62蛋白和其mRNA 的表达水平升高(P<0.05),而Beclin1、LC3蛋白和其mRNA表达水平下降(P<0.05)。见图5。

图5 各组小鼠结肠组织自噬相关分子P62、Beclin1、LC3蛋白和其mRNA表达水平比较

3 讨论

临床上UC 常表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便或里急后重等症状,可归属于中医学“腹痛”“泄泻”“痢疾”“休息痢”等范畴[10-11]。复方苦参汤由苦参、地榆、白及、甘草、青黛、三七组成,具有清热解毒化湿、固涩止泻、消肿生肌、调气行血、止血等功效[12]。复方苦参汤治疗UC 具有明显的临床效果,且通过实验证明复方苦参汤对结肠炎大鼠具有免疫调节作用,可抑制结肠的炎症反应,减轻肠上皮屏障的损伤,缓解临床症状[12-14]。

本研究采用DSS 建立UC 小鼠模型。该方法操作简单、重复性强,动物的病理表现与人类UC 临床表现相似,成为研究UC 发病机制及评估治疗药物疗效的主要模型[15]。本研究发现,造模后小鼠精神萎靡,体质量下降,出现肉眼黏液脓血便和稀水样黄便、黑便,DAI及CMDI 评分较高。结肠长度的变化在一定程度上能反映结肠炎症的水平[16]。通过解剖发现,模型小鼠结肠长度明显缩短,结肠黏膜局部充血、水肿,溃疡明显。HE 结果发现,模型小鼠结肠组织的完整结构被破坏,黏膜层有大量的炎症细胞浸润,杯状细胞减少,腺体结构破坏,有大量的异常增生组织。复方苦参汤组及美沙拉嗪组小鼠大便性状、血便等一般症状显著改善,体质量下降,DAI 评分降低;结肠黏膜充血水肿和结肠挛缩改善,CMDI 评分降低;在病理组织变化中发现,结肠的病理损伤程度改善,炎症细胞浸润减少,说明复方苦参汤对慢性UC小鼠结肠黏膜有一定的改善作用。

自噬是一种常见的细胞程序性死亡机制,是细胞内降解过量、受损或老化的蛋白质和细胞器以维持细胞内平衡的过程[17]。自噬功能障碍在破坏肠道稳态、影响肠道微生物组成和加剧肠道炎症方面具有关键作用[3]。Beclinl、LC3 和P62 是参与自噬过程的3 个主要分子,也是检测自噬水平的关键指标。Beclin1 能促进自噬启动,LC3 作为自噬体膜上的标记蛋白,存在于自噬溶酶体的降解过程中,二者表达水平和自噬水平呈正相关;而自噬底物蛋白P62通过在C端与泛素化蛋白结合以及N 端与LC3-Ⅱ结合参与自噬的降解,其表达水平与自噬活性呈负相关[18]。相关研究[19]证实,自噬可以通过维持正常肠道菌群和黏液来改善UC 的进展。在自噬过程中,LC3-Ⅱ是反映自噬活性的蛋白,通过阻断mTOR 信号通路,可以上调LC3-Ⅱ,增强自噬水平,进而减轻肠道炎症程度[20-21]。本研究中,模型组的Beclinl、LC3 表达较正常组减少,P62 增多,说明UC 小鼠结肠组织自噬为低水平表达状态,而在复方苦参汤及美沙拉嗪干预后,Beclin1、LC3 的表达水平明显升高,P62 的表达水平下降,这说明复方苦参汤的部分效应与美沙拉嗪相同,即复方苦参汤和美沙拉嗪能够促进自噬。自噬缺陷与炎症性肠病的发病机制密切相关,促进自噬可通过调节炎症水平、增强肠道病原体的清除而对炎症性肠病发挥治疗作用[22]。综上所述,复方苦参汤可调节UC 小鼠炎症因子的表达,改善结肠损伤等症状,这可能与其抑制自噬相关分子Beclinl、LC3和P62 的表达有关,具体的作用机制有待进一步深入研究。

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