三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 的HPLC定量分析及其肠黏膜渗透性研究

王筱懿，仇 坤，陈 明，彭桂明，赖树生，蒋腾川，尉小慧，王峥涛

1.上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室（上海 201203）；2.广西梧州中恒集团股份有限公司（广西 梧州 543000）；3.广西中恒创新医药研究有限公司（广西 南宁 530000）

肠道是人体体腔内与外界环境接触面最大的器官，容易受到肠道病原体的入侵和破坏，而肠道表面的黏液层是肠道吸收的重要屏障，被称为肠黏液屏障［1］。肠黏液屏障由黏蛋白、水、无机盐、免疫分子和促进致病菌清除的抗菌肽等组成［2］。肠黏液的主要结构成分是黏蛋白，这些蛋白由高度糖基化的蛋白主链组成，黏液蛋白单元之间的二硫化物桥接形成黏液的网状结构［3］，使黏液能够调节一些微粒和小分子的扩散。黏液层可捕获病原体和外来颗粒，并通过不断分泌黏液使肠道表面保持湿润和不断更新，从而减少捕获的病原体和外来颗粒在肠黏膜表面的停留时间，进而有利于维持肠道环境稳定［4-5］。黏蛋白和水形成的凝胶网状结构还可为肠上皮细胞分泌的免疫分子提供扩散和稳定的场所，以更好地发挥其抗菌功能［6］。同时，小肠可通过运动将黏液及其中渗透的细菌等物质推向远端［7］。然而，肠黏液的这种屏障功能在起到保护作用的同时，也会阻止药物在黏膜表面的持续和靶向输送［8］。因此，了解黏液的屏障特性、研究药物在肠黏液层的渗透过程是探讨药物口服吸收机制的必要环节。

三七是五加科人参属植物三七Panaxnotoginseng（Burk.） F.H.Chen 的干燥根及根茎，具有活血化瘀、消肿定痛等功效，临床应用广泛［9］。其主要活性成分为三七总皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）。《中华人民共和国药典（2020年版）：一部》［10］规定用于口服的三七总皂苷提取物中三七皂苷R1（C47H80O18）不得少于5.0%，人参皂苷Rg1（C42H72O14）不得少于25.0%，人参皂苷Rb1（C54H92O23）不得少于30.0%。三七皂苷R1 是三七的代表性成分，而人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1 是三七总皂苷中含量最高的两个成分，因此选取这3种皂苷成分作为研究对象。

目前临床常用的三七总皂苷制剂以口服制剂和注射制剂为主［11］，相关的细胞转运、肠吸收、口服生物利用度等方面的研究较多，但进入体内口服吸收的第一道屏障——肠黏液的渗透过程却鲜有研究报道。体外模型通常具有替代、简化、精准等特点［12］，本课题采用前期建立的3 种体外肠黏液渗透模型——纯化黏蛋白渗透模型（purified mucin infiltration model，PIM）、人工肠黏液渗透模型（artificial intestinal mucus infiltration model，AIM）及大鼠肠黏液渗透模型（rat intestinal mucus infiltration model，RIM），研究三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的肠黏液渗透作用，进而为三七皂苷的口服吸收机制研究以及口服新制剂的设计提供科学依据。

1 材料

1.1 药物与试剂 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 及人参皂苷Rb1 ，购自成都德思特生物技术有限公司（批号分别为DSTDS005003、DSTDR000902、DSTDR000603）；磷酸，上海拜力生物科技有限公司（批号：20800100）；猪肠胃黏蛋白，上海源叶生物科技有限公司（批号：A11GS157442）；卵磷脂（E-80，浓度≥80%），上海麦克林有限公司（批号：C11134241）；卵磷脂酰胆碱（PC）、卵磷脂乙醇胺（PE）、卵磷脂丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、胆固醇（Chol），上海源叶生物科技有限公司（批号分别为579010-150055-13、J21HS185636、J23HS185824、TO7D6-F6559、L29N8F49258）；侵袭实验（Transwell）小室，美国Corning 公司（批号：33721054）；三氯甲烷、乙腈，国药集团药业股份有限公司（批号分别为20210514、20221209）。

1.2 主要仪器 电子分析天平，瑞士Mettler Toledo 公司（型号：BP211D ）；离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司（型号：SF-TGL-16M ）；超声清洗仪，昆山市超声仪器有限公司（型号：KQ-250DB）；磁力搅拌器，德国AKI有限公司（型号：RT10）；高效液相色谱（HPLC）仪，美国安捷伦公司（型号：Agilent 1260 Series）。

2 方法

2.1 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 HPLC分析方法的建立

2.1.1 对照品溶液制备 称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 各10 mg，分别加入甲醇10 mL，得到1 g·L-1的单标品溶液，制得对照品溶液。

2.1.2 样品溶液制备 在PIM、AIM、RIM 中，取不同浓度不同时间点的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 的接收室溶液各100 μL，10 000 r·min-1离心5 min，0.45 μm滤膜过滤后制得样品溶液。

2.1.3 色谱条件

（1）三七皂苷R1测定色谱条件。色谱柱：Diamonsil Plus（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：35 ℃；流动相：A 为乙腈，B为0.1%磷酸水溶液。梯度洗脱：0～15 min，17%～27% A；15～18 min，27%～90% A。检测波长：203 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。

（2）人参皂苷Rg1 测定色谱条件。流动相：A 为乙腈，B 为0.1%磷酸水溶液，A∶B=22%∶78%，15 min 等度洗脱；其他同三七皂苷R1测定条件。

（3）人参皂苷Rb1 测定色谱条件。流动相：A 为乙腈，B 为0.1%磷酸水溶液，A∶B=31%∶69%，15 min 等度洗脱；检测波长：205 nm；其他同三七皂苷R1 测定条件。

2.1.4 标准曲线的制备 取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品溶液，依次稀释制成浓度分别为10、40、62.5、125、250、700及1 000 mg·L-1的混合对照品溶液。取10 μL在“2.1.3”项色谱条件下进行HPLC检测分析，记录峰面积，以对照品浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rg1的线性回归方程和线性范围。

2.1.5 方法学考察

（1）精密度试验。取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1 对照品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进行HPLC 检测分析，每次进样10 μL，连续进样6 次，记录峰面积，计算RSD值。

（2）稳定性试验。取同一样品溶液在不同时间（0、4、8、12、24、48 h）分别进样10 μL，进行HPLC 检测分析，记录峰面积，计算RSD值。

（3）重复性试验。精密吸取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 的样品溶液进行HPLC 检测分析，平行6次试验，记录峰面积，计算RSD值。

（4）加样回收试验。精密吸取已知浓度的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1样品溶液100 μL，分别加入含量为80%、100%、120%的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的对照品溶液，按照样品溶液处理方法处理后用甲醇定容，在“2.1.3”项色谱条件下进样分析，计算三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的加样回收率。

2.2 体外肠黏液渗透模型的建立与皂苷类成分表观渗透系数（Papp）测定 利用Transwell 小室的扩散原理，以Transwell 小室为主要工具，建立PIM、AIM 和RIM。如图1 所示，将Transwell 小室分别分为4 个部分：接收室（A）、半透膜（B）、黏液层（C）、供体室（D）。其中3 种模型的主要不同在于黏液层，分别为纯化的黏蛋白溶液、人工肠黏液及大鼠原生黏液层。见图1。

图1 侵袭实验渗透系统的示意图

将Transwell 渗透体系插入一定体积的磷酸盐缓冲液（PBS）中，然后将三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 配制成一定浓度的药液后，加入供体室，置于黏液层上，在不同时间点收集接收室中的样品溶液，HPLC进样检测并计算Papp。

Papp 的大小反映药物透过模型的能力以及速度，其计算公式如下：Papp= （dQ/dt）×1/A×1/C0。其中，dQ/dt为接收室在单位时间内的累积转运量，A为Transwell的膜表面积，C0为药物加入供体室的起始浓度。

2.2.1 PIM 的建立及3 种皂苷成分Papp 测定［13］称取适量的黏蛋白，用pH 7.2 的PBS 溶液配制浓度为20 g·L-1的纯化黏蛋白溶液。取空白Transwell小室，加入浓度为20 g·L-1的黏蛋白溶液，使其厚度为3.82 mm，36 ℃孵育5 min制得PIM。

称取适量的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 至2 mL 容量瓶，用pH 7.2 的PBS 溶液配制成浓度分别为20、10、5 g·L-1的溶液。在PIM 中，分别加入上述不同浓度的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 溶液各100 μL，将模型插入1.5 mL、pH 7.2 的PBS 溶液中，于0.5 h、1 h 取接收室溶液100 μL，再补足相应的100 μL 的PBS 溶液至接收室，10 000 r·min-1离心5 min，采用HPLC检测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量。

2.2.2 AIM的建立及3种皂苷成分Papp测定［14］

（1）脂质体1。称取0.5 g 的E-80 并溶解在10 mL 氯仿和乙醚混合物（体积分数2∶1）中，加入圆底烧瓶中，36 ℃减压蒸发除去有机溶剂，加入25 mL 的PBS 溶液（pH 7.4），缓慢摇晃烧瓶获得2%（W/V）脂质体分散体，通过孔径为0.25 μm滤膜得到脂质体1。

（2）脂质体2。称取 PC（W/W为26.5%）、PE（W/W为26.5%）、PS（W/W为7%）、PI（W/W为7%）、Chol（W/W为33%）共计0.5 g，加入圆底烧瓶中，36 ℃减压蒸发除去有机溶剂，加入25 mL 的PBS 溶液（pH 7.4），缓慢摇晃烧杯获得2%（W/V）脂质体分散体，通过孔径为0.80 μm滤膜得到脂质体2。

取200 μL 脂质体1 置于Transwell 小室半透膜上，并以2 300 r·min-1离心5 min，50 ℃加热45 min，重复2次。然后继续取100 μL 脂质体2 加入至脂质体1 ，以2 300 r·min-1离心5 min，50 ℃加热45 min，重复2 次。然后取上述Transwell 小室于-80 ℃条件下冷冻保存至少60 min，在实验前于50 ℃条件下解冻60 min。

在上述模型中分别加入不同浓度的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1溶液，取样时间改为2 h、4 h，其余操作同“2.2.1”项下方法。

2.2.3 RIM 的建立及3 种皂苷成分Papp 测定［15］取新鲜大鼠肠黏液，-80 ℃条件下冻存，使用前室温复融，在空白Transwell 小室中加入大鼠小肠黏液0.4 g，36 ℃孵育5 min制得RIM。

在上述模型中加入不同浓度的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 溶液，取样时间改为0 h、1 h，其余操作同“2.2.1”项下方法。

2.3 统计学方法 将数据导入GraphPad 7.0 软件，采用SPSS 25.0 软件进行数据的描述和分析。计量资料以xˉ±s表示，两组之间采用独立样本t检验进行差异显著性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 3 种皂苷成分HPLC线性范围及方法学考察结果

3.1.1 线性范围考察 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 的线性回归方程依次为y=2.248 4x-0.592 5（r2=0.999 5），y=3.719 4x-1.737（r2=0.999 5），y=2.269 3x-31.16（r2=0.999 0），表明三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 在10～1 000 mg·L-1浓度范围内呈现良好的线性关系。见图2。

3.1.2 精密度试验 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 的RSD值分别为0.47%、0.12%、0.18%（n=6），表明仪器的精密度良好。

3.1.3 稳定性试验 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 的RSD值分别为2.1%、2.9%、1.9%，表明供试品溶液的稳定性良好。

3.1.4 重复性试验 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1的平均含量分别为369.68、41.54、25.90 mg·g-1，RSD值分别为1.3%、2.0%、1.0%（n=6），表明方法的重复性良好。

3.1.5 加样回收试验 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 的平均加样回收率分别为99.72%、101.26%、99.14%，RSD值均<2%，表明方法的准确度良好。见表1。

表1 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的加样回收率

3.2 3 种皂苷成分在PIM 中的Papp 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 在PIM 中的Papp 实验测定结果显示，在PIM 中，随着浓度的升高，3种皂苷成分的渗透性都有不同程度的增加；三七皂苷R1 在不同浓度下的Papp都有显著增加，与人参皂苷Rb1组、人参皂苷Rg1 组差异有统计学意义（P<0.05）；人参皂苷Rb1 组与人参皂苷Rg1 组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1在纯化黏蛋白渗透模型（PIM）中的表观渗透系数比较（±s）

表2 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1在纯化黏蛋白渗透模型（PIM）中的表观渗透系数比较（±s）

注：与三七皂苷R1比较，*P<0.05。

成分表观渗透系数/（cm·s-1·10-5）5 g·L-1 18.07±0.40 4.81±0.23*5.47±0.10*20 g·L-1 30.82±0.07 7.36±0.02*7.90±0.02*三七皂苷R1人参皂苷Rg1人参皂苷Rb1 10 g·L-1 21.88±0.70 6.67±0.04*6.82±0.08*

3.3 3 种皂苷成分在AIM 中的Papp 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 在AIM 中的Papp 实验测定结果显示，在AIM 中，随着浓度的升高，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 的渗透性都有不同程度的增加，在20 g·L-1浓度下的Papp 为三七皂苷R1>人参皂苷Rb1>人参皂苷Rg1（P<0.05）。见表3。

表3 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1在人工肠黏液渗透模型（AIM）中的表观渗透系数比较（±s）

表3 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1在人工肠黏液渗透模型（AIM）中的表观渗透系数比较（±s）

注：与三七皂苷R1比较，*P<0.05；与人参皂苷Rg1比较，#P<0.05。

成分表观渗透系数/（cm·s-1·10-5）5 g·L-1 4.53±0.35 2.34±0.01 2.52±0.10 20 g·L-1 11.56±0.07 5.37±0.01*7.84±0.04*#三七皂苷R1人参皂苷Rg1人参皂苷Rb1 10 g·L-1 6.07±0.15 3.00±0.06 4.15±0.05

3.4 3 种皂苷成分在RIM 中的Papp 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 在RIM 中的Papp 实验测定结果显示，在RIM 中，随着浓度的升高，三七皂苷R1 和人参皂苷Rg1的渗透性增加幅度较大，而人参皂苷Rb1增加幅度较小；在5 g·L-1浓度下，人参皂苷Rg1 的渗透性较人参皂苷Rb1 显著升高（P<0.05）；在10 g·L-1浓度下，三七皂苷R1 和人参皂苷Rg1 比人参皂苷Rb1 的渗透性显著升高（P<0.05）；在20 g·L-1浓度下的Papp 为人参皂苷Rg1>三七皂苷R1>人参皂苷Rb1（P<0.05），与PIM、AIM模型渗透趋势不同。见表4。

表4 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1在大鼠肠黏液渗透模型（RIM）的表观渗透系数（±s）

表4 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1在大鼠肠黏液渗透模型（RIM）的表观渗透系数（±s）

注：与三七皂苷R1比较，*P<0.05；与人参皂苷Rg1比较，#P< 0.05。

成分三七皂苷R1人参皂苷Rg1人参皂苷Rb1表观渗透系数（Papp）/（cm·s-1·10-5）5 g·L-1 4.28±0.45 8.73±0.07 2.45±0.01#20 g·L-1 13.53±0.33 20.31±0.64*4.82±0.13*#10 g·L-1 7.25±0.71 12.59±0.03 3.46±0.17*#

4 讨论

随着浓度的增加，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1 在3 种肠黏液渗透模型中的渗透性均有所增加。在不同浓度下，3 种皂苷成分在3 种模型中的渗透规律略有不同，在脂类成分较少的PIM 和AIM 中，水溶性成分渗透较强，如三七皂苷R1；而在RIM 中，脂溶性成分渗透作用较强，如人参皂苷Rg1。

4.1 在PIM 中 在不同浓度下，三七皂苷R1 的渗透性明显优于人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1。模型中药物渗透的主要驱动力为被动扩散，药物水溶性是影响药物被动扩散的原因之一［16］。一方面，三七皂苷R1 的水溶性依次高于人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1［17］；另一方面，纯化黏蛋白溶液缺失了磷脂层结构［18］，模型本身脂溶性相对减少，使得PIM 中水溶性较高的三七皂苷R1具有较强的渗透性。

4.2 在AIM 中 AIM 药物浓度为5 g·L-1和10 g·L-1时趋势不显著，当浓度升高为20 g·L-1时，随着药物浓度的上升渗透性也随之增加，三七皂苷R1 的渗透性最佳，人参皂苷Rb1 其次，人参皂苷Rg1 渗透性较差。但相较于3 种皂苷在PIM 中的渗透性，人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1更接近于三七皂苷R1的渗透性。这可能是因为AIM 中含有细胞膜相似的脂质组成成分及结构，具备较好的生物相容性［19］，所以相对于PIM 有利于提高亲脂性皂苷的渗透性［20］。

4.3 在RIM 中 随着药物浓度的上升，3 种皂苷成分的渗透性也逐步增加，表明提高浓度对药物渗透效率具有一定的促进作用。在浓度为20 g·L-1时，3 种皂苷成分的Papp 为人参皂苷Rg1>三七皂苷R1>人参皂苷Rb1（P<0.05）。RIM 为原生大鼠肠黏液渗透模型，能体现真实的肠道环境。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 均属于原人参三醇型皂苷，更易被肠道吸收［21］，且人参皂苷Rg1 的亲脂性大于三七皂苷R1，所以人参皂苷Rg1 在RIM中的渗透性最强。三七皂苷R1较人参皂苷Rb1渗透性高的原因可能在于其分子量比人参皂苷Rb1 的分子量小，更易透过大鼠肠黏液。

4.4 其他 建立的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 的HPLC 含量测定分析方法，其精密度、稳定性、重复性、加样回收率良好，可用于体外肠黏液渗透模型的3种三七皂苷单体成分的含量测定。

三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 和人参皂苷Rb1 在PIM、AIM、RIM 中稳定性良好，均可单独用于药物的渗透性评价。

药物的肠道渗透性决定药物被人体吸收的速率和程度，并进一步决定了药物口服生物利用度的高低［22］。目前大多数文献主要通过针对三七总皂苷或其单体的口服生物利用度进行研究，探讨整个肠黏膜屏障对药物吸收的影响［23-24］，但缺少对吸收过程中肠道黏液影响的研究。本实验通过多种体外肠黏液渗透模型研究3 种三七皂苷单体成分在肠道部位的渗透作用，并对3种成分在肠黏液中的渗透规律进行探讨。该研究结果可与三七皂苷单体成分的口服药代动力学结果进行互证，为三七皂苷类成分的口服吸收机制研究提供实验依据，进而为三七总皂苷口服新制剂的设计及进一步的临床应用、开发提供思路。同时，也为其他口服药物进行肠黏液渗透性研究时如何选择适合的模型提供参考。