康莱特注射液对人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810生长、凋亡、迁移的影响*

史亚波 周梦娜 刘华兵 殷俊翔 曹振军 龚帅昌#

（1 南昌大学医学院 江西 南昌 330006；2 江西省人民医院 南昌 330006；3 南昌医学院第一附属医院 江西 南昌 330006）

胆管癌是继肝细胞癌之后的第二大常见肝脏恶性肿瘤，在过去的40 年中，胆管癌的总体发病率在全球范围内逐渐增加[1]。手术是首选治疗方案，但大多数患者处于疾病中晚期，无法根治性治疗影响其结局。康莱特注射液是一种双相广谱抗肿瘤药物，用于治疗多种原发性恶性肿瘤，包括肺癌、肝癌、胃癌和乳腺癌，其在体外和体内肿瘤模型中被证实对许多肿瘤细胞系具有抗增殖和促凋亡作用[2]。临床应用证明，康莱特与化疗、放疗或手术相结合，可显著降低癌症恶病质，提高癌症患者的生活质量，改善预后[3]。而康莱特注射液是否可用于胆管癌的临床治疗以及作用机制等方面的相关研究甚少。本研究采用人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 作为研究对象，探讨康莱特注射液可能的抗肿瘤相关机制，为胆管癌临床诊断及药物治疗筛选提供新的理论依据。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 材料 人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810（上海康朗生物科技有限公司），临床药物100 mg/ml 康莱特注射液（国药准字Z10970091），RPMI-1640 培养基（美国GIBCO 公司），10%胎牛血清（FBS，美国GIBCO 公司），磷酸盐缓冲盐水（PBS）和胰蛋白酶-EDTA（德国Merck 公司），CCK-8 试剂盒和蛋白提取试剂盒（上海碧云天公司），Transwell 小室（北京萌壮科技有限公司），兔抗人Bcl-2、Bax 和Caspase-3 单克隆抗体（美国CellSignaling 公司），鼠抗人GAPDH 单克隆抗体（美国Abcam 公司），0.1%结晶紫染色液（广州和为医药科技有限公司），碘化丙啶（北京奥莱博科技有限公司），4%多聚甲醛溶液（湖北科沃德化工有限公司），辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（美国Santa Cruz 公司），RIPA 细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司），Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（美国BD 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 取用人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 分别置于内含10%FBS 及1%青霉素链霉素的RPMI-1640 培养基中，在37℃、5%CO2和98%相对湿度的培养箱中培养，在pH 7.4 下用PBS洗涤，并用胰蛋白酶-EDTA（0.25%）分离传代后取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 运用CCK-8 法检测康莱特注射液对人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 的增殖影响 采用100 mg/ml 康莱特注射液处理人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810（制备成单细胞悬液），取对数生长期的细胞分别以每孔5×103个细胞/ml 接种于96 孔板中，继续培养，四周用PBS 填满，作为实验组，同时以此方法设置空白对照组（康莱特浓度为0 mg/ml）。分别在24 h、48 h、72 h、96 h 4 个时间段检测每个时间段的细胞生长状态，设置6 个复孔，加入10 μl CCK-8 溶液，在37℃、5%CO2和98%相对湿度培养箱中培养2 h 后酶标仪测定450 nm 波长处各孔的吸光度（OD 值），同时绘制生长曲线，实验重复3 次。

1.2.3 运用流式细胞仪测定人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 的凋亡情况 采用100 mg/ml 康莱特注射液处理人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810，取对数生长期的细胞分别接种5×105个细胞至6 孔板，置于37℃、5%CO2和98%相对湿度培养箱中培养48 h 后，离心收集上述细胞，作为实验组，以同样的方式进行空白对照组处理（康莱特浓度为0 mg/ml）。同时用预冷的PBS 洗涤细胞并重悬，将细胞悬液（400 μl）加入15 μl Annexin V-FITC、10 μl 碘化丙啶（PI）中充分混匀，孵育20 min 后用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，分析细胞凋亡并记录，实验重复3 次，用FlowJo V10 软件处理。

1.2.4 Transwell 实验检测人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 的迁移能力 采用100 mg/ml 康莱特注射液处理人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 作为实验组，并细胞计数，另设空白对照组（康莱特浓度为0 mg/ml）。将细胞沉淀用无FBS 的培养基进行稀释（1:6），并调整浓度为1×105个/ml，取80 μl 细胞悬液接种于上室。在下室中加入含有10%FBS 作为趋化剂的培养基。在37℃、5%CO2和98%相对湿度培养箱中培养24 h，取出Transwell 小室，PBS 冲洗，用棉签拭去上下室的液体，使用4%多聚甲醛溶液固定20 min，后再次PBS 冲洗，并用0.1%结晶紫染色30 min，后显微镜下观察、拍照计数，实验重复3 次。

1.2.5 Western Blot 检测人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 信号通路中关键蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax 的表达 采用100 mg/ml 康莱特注射液处理48 h 的人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 作为实验组，以同样的方式进行空白对照组处理（康莱特浓度为0 mg/ml）。后分别用PBS 洗涤细胞2 次，使用RIPA 缓冲液充分裂解细胞，于冰上裂解30 min 后离心，取上清，使用二辛可酸法（BCA）法测定蛋白质浓度，通过SDS-PAGE 在80 V 电泳下分离1.5 h，并在100 V 电泳下转移到PVDF 膜2 h。5%脱脂奶粉封闭，加入一抗Caspase-3（1:1 000）、Bcl-2（1:2 000）、Bax（1: 2 000）及内参GAPDH（1:2 000）在4℃室温下孵育过夜。然后在室温下与HRP 缀合的多克隆IgG（1:1 000）（二抗）结合，孵育2 h，PBST 洗涤5 min×3 次，使用数字成像仪拍照，并使用Image J 进行灰度值比较分析记录，实验重复3 次。

1.3 统计学方法 采用Graphpad Prism 8.0 软件对所有数据进行统计学分析，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 康莱特注射液对人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 增殖的影响康莱特注射液（100 mg/ml）处理RBE 和HCCC9810 细胞后，与对照组（康莱特浓度为0 mg/ml）相比，随着药物作用时间的延长，显著降低了RBE 和HCCC9810 细胞的活力，抑制细胞增殖，并且抑制程度存在时间依赖性，随作用时间的延长而逐步增加，96 h 时最为明显（P＜0.05）。见图1、表1 与图2、表2。

表1 康莱特对人胆管癌细胞RBE 增殖的影响（）

注：n=3 是指重复了3 次实验。

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表2 康莱特对人胆管癌HCCC9810 细胞增殖的影响（）

表2 康莱特对人胆管癌HCCC9810 细胞增殖的影响（）

注：n=3 是指重复了3 次实验。

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图1 康莱特对人胆管癌细胞RBE 增殖的影响

图2 康莱特对人胆管癌HCCC9810 细胞增殖的影响

2.2 康莱特注射液对人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 凋亡率的影响 采用流式细胞术计算细胞凋亡率，经康莱特注射液（100 mg/ml）处理48 h后，与对照组相比（康莱特浓度为0 mg/ml），康莱特注射液能加速RBE 和HCCC9810 细胞凋亡（P＜0.05）。见图3、表3 和图4、表4。

表3 康莱特对人胆管癌RBE 细胞凋亡的影响（%，）

表3 康莱特对人胆管癌RBE 细胞凋亡的影响（%，）

注：n=3 是指重复了3 次实验。

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表4 康莱特对人胆管癌细胞HCCC9810 凋亡的影响（%，）

表4 康莱特对人胆管癌细胞HCCC9810 凋亡的影响（%，）

注：n=3 是指重复了3 次实验。

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图3 康莱特对胆管癌RBE 细胞凋亡的影响

图4 康莱特对人胆管癌细胞HCCC9810 凋亡的影响

2.3 蛋白质印迹法检测结果 人胆管癌细胞RBE和HCCC9810 经100 mg/ml 康莱特注射液处理48 h后，与对照组比较（康莱特浓度为0 mg/ml），凋亡通路中的关键蛋白Bcl-2、Bax 和Caspase-3 被检测到。随着作用时间的延长，Caspase-3 蛋白表达增加，Bcl-2 逐渐开始减少，Bax 随药物作用时间的增加呈现逐渐上调的趋势（P＜0.05）。见图5、图6。

图5 康莱特对人胆管癌细胞RBE 凋亡通路中的关键蛋白Caspase-3、Bcl-2 及Bax 蛋白表达水平的影响

图6 康莱特对人胆管癌细胞HCCC9810 凋亡通路中的关键蛋白Caspase-3、Bcl-2 及Bax 蛋白表达水平的影响

2.4 康莱特注射液对人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 迁移能力的影响 （Transwell 小室实验结果）观察显微镜单视野下穿过小室的人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 细胞数量见图7、图8 及表5。结果显示，随着康莱特用药时间的延长，在显微镜单视野下穿过小室的RBE 和HCCC9810 细胞数量与对照组相比较，迁移细胞的数量明显减少（P＜0.05）。

表5 康莱特对人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 迁移能力的影响（个/ 高倍镜，）

表5 康莱特对人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 迁移能力的影响（个/ 高倍镜，）

注：n=3 是指重复了3 次实验。

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图7 康莱特对人胆管癌细胞RBE 迁移能力的影响（结晶紫染色200）

图8 康莱特对人胆管癌细胞HCCC9810 迁移能力的影响（结晶紫染色200）

3 讨论

胆管癌是一种起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤。它是仅次于肝细胞癌的第二大最常见的原发性肝恶性肿瘤，约占所有原发性肝肿瘤的15%和所有胃肠道癌症的3%[4]。然而，过去几十年中，胆管癌的发病率和病死率在全球范围内不断增加，这对公共卫生带来了巨大的挑战，其预后较差。目前，胆管癌的主要治疗方案仍是外科手术切除，辅以化疗。但是，即使进行根治性手术，患者的5 年生存率仍然较低，中位生存时间不到12 个月。这主要是由于胆管癌常常在晚期才被发现，且易于转移和复发。近年来中医药制剂在肝胆肿瘤的治疗中起到重要的作用，例如能够提高外科手术成功率、改善机体内环境、调节患者免疫力等，同时联合应用化疗药物不仅能降低化疗所带来副反应，还能使其抗肿瘤作用增效，从而提高治疗效果[5～6]。

抗肿瘤药物康莱特注射液的有效成分薏苡仁，具有多种抗癌作用，其主要活性成分是含有4 种脂肪酸的甘油三酯化合物，可以作用于肿瘤细胞的G2/M 期，抑制细胞的有丝分裂及生长[7]。此外，康莱特注射液还能有效地抑制肿瘤血管的形成、促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖[8]。研究表明，康莱特注射液可以通过对Na+/K+-ATP 酶的抑制来调控肿瘤生长及影响其细胞周期，进而产生抗癌作用[9]。此外，康莱特已被证明通过调节PI3K/Akt/mTOR 信号通路来诱导细胞凋亡并抑制癌细胞增殖，从而增强肿瘤细胞对化疗的敏感性[10～11]。康莱特还可激活机体免疫系统，如NK 细胞的活性，增加CD4+/CD8+的比例，使白细胞介素（IL）-2 水平分泌增多，降低转录调节核因子-κB（NF-κB），促进吞噬细胞的吞噬功能及脾淋巴结的增殖，通过免疫调节作用在体内表现出抗肿瘤活性[12～13]。这些作用在体内表现出抗肿瘤活性，使康莱特注射液成为一种重要的抗癌药物，但康莱特注射液是否能影响人胆管癌细胞RBE 和HCCC98100 生长、凋亡、迁移，相关报道不多见。

本研究发现，康莱特注射液在作用于人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 后，与对照组相比，康莱特注射液能够抑制人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810的增殖、迁移能力，诱导其发生凋亡，机制可能与凋亡信号通路关键蛋白Caspase-3、Bax 和Bcl-2 有关。Bcl-2 家族的促凋亡和抗凋亡因子通过复杂的相互作用共同决定着细胞进程，抗凋亡蛋白Bcl-2 高表达时，形成Bcl-2/Bax 异源二聚体，保护细胞，抑制凋亡；而促凋亡蛋白Bax 高表达时形成Bax/Bax 同源二聚体，通过从线粒体中释放细胞色素C 和抑制Bcl-2 的抗凋亡作用使细胞趋向凋亡。所以，Bcl-2 与Bax 比例大小决定着细胞的最终归宿[14]。Bax 是最知名的直接影响细胞凋亡的下游p53 转录靶标之一，同时Bcl-2 和Bax 的表达均受抑癌基因p53 的调节，p53 已被证明可直接激活促凋亡蛋白Bax、Caspase-3，从而促进细胞凋亡[15]。Caspase 是程序性细胞死亡的关键介质，凋亡的早期启动和晚期进展与之密切相关。激活Caspase-3 使其表达后能够催化许多关键细胞蛋白发生特异性裂解。Caspase-3 通过自身蛋白水解切割、加工、激活组装核酸内切酶，使核体间DNA 断裂，导致细胞凋亡，其第2 个途径涉及线粒体的参与，线粒体将Caspase 激活蛋白释放到细胞质中，从而形成凋亡小体。Caspase-3 也可介导PAK2 和凝溶胶蛋白裂解导致细胞凋亡[16]。通过本研究，实验组中康莱特注射液作用于人胆管癌RBE 和HCCC9810 后，Caspase-3、Bax 蛋白表达明显上调，Bcl-2 蛋白表达下调；基于上述研究结果，康莱特注射液可能通过调控细胞凋亡信号通路关键蛋白Caspase-3、Bcl-2 和Bax 来抑制胆管癌的恶性生物学行为。

综上所述，本研究表明康莱特注射液可能是一种潜在的、治疗胆管癌的药物，可以抑制人胆管癌细胞RBE 和HCCC9810 的生长和迁移能力，促进其凋亡，机制可能与其能上调凋亡信号通路关键蛋白Caspase-3、Bax 和下调Bcl-2 蛋白表达有关。未来的研究还应进一步探讨康莱特注射液在胆管癌治疗中的具体作用机制，以及其与其他治疗方法的联合应用是否可以提高治疗效果。