补骨脂素治疗骨关节炎网络药理学预测及实验验证

王蔚陆 陈建新 朱 姜 梁丁龙 马彦旭

(1 北京中医药大学中医学院,北京,100029; 2 北京中医药大学厦门医院,厦门,361009; 3 首都医科大学附属北京中医学院,北京,100010)

骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种不由衰老引起,多受关节软骨生化改变与生物力学应力影响的退行性关节疾病。中医有“骨痹、膝痹、膝眼风”的相关记载。“骨痹”最早源于《黄帝内经·素问·长刺节论篇》[1],现代中医对其病因病机有了更全面的认识,认为素体年迈、骨节亏虚、筋骨失养,外加风寒湿邪侵袭,终致气血不通,脉络痹阻[2]。补骨脂又名破故纸、胡韭子[3]。蔷薇目,豆科植物成熟果实,出自《雷公炮炙论》。补骨脂素是补骨脂的主要成分,属于香豆素类化合物,能有效调控细胞因子,尤其是白细胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)通路所介导的滑膜-软骨交互作用。由于PSO在紫外线灯的照射下可产生光毒反应,有光致敏史的患者、儿童及孕妇应慎用。本文结合李梢教授提出的药理学的研究方法和评价标准[4-5],以受体或靶点为药物活性的治疗关键,探讨化合物作用受体机制及特性表达。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人原代OA滑膜成纤维细胞(货号:JY-J884,培养体系:1×原代细胞基础培养基500 mL,4 ℃避光保存;100×原代细胞培养添加剂5 mL,-20 ℃避光保存;终浓度10%胎牛血清50 mL,-20 ℃避光保存;100×青霉素-链霉素双抗混合液(Penicillin-streptomycin Solution,P/S)5 mL,-20 ℃避光保存),人原代OA软骨细胞(货号:JY-J905,培养体系:1×原代细胞基础培养基500 mL,4 ℃避光保存;100×原代细胞培养添加剂5 mL,-20 ℃避光保存;终浓度10%胎牛血清50 mL,-20 ℃避光保存;100×P/S 5 mL,-20 ℃避光保存),以上细胞购自上海瑾原生物科技有限公司,25 mL培养瓶放置在孵育箱中,细胞培养基于碳酸氢盐的缓冲体系,设置5% CO2气体环境,维持pH=7.2,温度37 ℃。

1.1.2 药物 药物:补骨脂素(成都瑞芬思德丹生物科技有限公司,批号:RFS-B06502005013)。

1.1.3 试剂与仪器 TransZol Up Plus RNA Kit(TRANS,批号:ER501-01-V2);TransScript® Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(TRANS,批号:AU341-02-V2);实时荧光定量PCR试剂盒(康为世纪,批号:CW0659)。凝胶电泳仪(Tanon,型号:EPS600);凝胶成像仪(Peiqing Science and Technology,型号:JS-2012);荧光定量PCR仪(ROCGENE,型号:Archimed-X4);Transwell小室(北京索莱宝生物科技,批号:Corning 3422)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 当原代培养细胞达到85%以上融合时进行消化传代,将传至第3代的滑膜细胞(1×104个/mL)和软骨细胞(8×104个/mL),分别种于Transwell小室的上室和下室,制备滑膜细胞和软骨细胞共培养体系,共培养4 d。

1.2.2 分组与干预方法 将软骨细胞-滑膜细胞体系随机分为补骨脂素低浓度组(1 μmol/L)、补骨脂素中浓度组(8 μmol/L)、补骨脂素高浓度组(50 μmol/L)以及空白对照组(0 μmol/L),共4组,干预48 h,每组留取Transwell小室下室软骨细胞的3个样本进行指标检测。

1.2.3 检测指标与方法 依据网络药理学预测结果,选取IL-17、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)和核因子κB作为药物干预细胞共培养体系的观测对象,采用实时荧光定量PCR观察不同浓度补骨脂素对模型细胞中网络药理学预测相关信号通路关键分子mRNA水平表达量的影响。

1.3 网络药理学分析

1.3.1 补骨脂素靶点获取 通过SymMap2.0(http://www.symmap.org/)平台检索化合物靶点[6],中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)以及文献补充化合物靶点信息,利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)规范靶点名称。

1.3.2 OA的基因获取 分别向GeneCards(http://www.genecards.org/)、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,https://omim.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)等数据库输入Osteoarthritis,获得疾病基因,参考《网络药理学评价方法指南》可靠性、规范性和合理性的定义,以相关性大小为依据筛选关键基因[4]。

1.3.3 补骨脂素治疗疾病核心靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络、生物富集分析和通路分析 将PSO与OA靶点取交集,得到化合物治疗疾病的位点。将关键靶点导入String(https://string-db.org/)数据库,获取蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)网络,使用Cytoscape绘制模型,节点表示蛋白,线表示相互关系。节点越大,颜色越深越重要。线越粗,颜色越深,联系越紧密。

使用Metascape(http://metascape.org/)平台,导入16个靶点,设置种属为人类,进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析,包含生物过程(Biological Process,BP)、细胞组分(Cell Component,CC)及分子功能(Molecular Function,MF),根据富集系数(Enrichment)大小进行排序,保留排名靠前的结果;使用Cytoscape插件ClueGO进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,Kappa系数选中等,绘制yFiles Tree Layout图。

1.3.4 病症结合研究补骨脂素治疗作用 首先下载补骨脂素化合物(Ingredients)相关的草药(Herb)、疾病(Disease)、中医证候(Traditional Chinese Medicine Syndrome,TCM Syndrome)、现代医学症状(Modern Medicine Symptom,MM Symptom)和综合征(Syndrome)板块;其中Disease内容较多,使用“炎、痛、骨、关节、脊、椎”为关键词筛选OA相关疾病。

然后下载OA疾病相关的TCM Syndrome、MM Symptom和Syndrome板块。

最后将PSO和OA二者对应的TCM Syndrome、MM Symptom和Syndrome板块条目取交集,建构PSO和OA之间的联系。确定核心Syndrome和TCM Syndrome后,下载其对应的草药Herb,用Cytoscape软件绘制化合物-草药-症状体征图(Ingredients-herb-syndrome/TCM Syndrome)。黄色圆形节点表示PSO,粉色菱形节点表示OA患者的Syndrome,橘黄菱形节点表示OA患者TCM Syndrome,中草药用蓝方形节点表示,其中深蓝方形节点代表核心中药。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism5.0统计软件进行数据统计,采用单因素方差分析进行组间差异比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 补骨脂素治疗OA的靶点选取 药物方面,涉及26个PSO靶点,结合TCMSP及文献报道补充靶点,共计27个。疾病方面,获得靶点741个,最后将27个PSO靶点与741个OA靶点取交集,得到16个PSO精准治疗OA的靶点。

2.2 共有靶点PPI网络建构 PSO治疗OA靶点的PPI网络共涉及15个节点,46条边,独立节点EFEMP1未纳入网络,剩余15个节点按节点间联系次数由高到低排序,依次为TNF、FOS、ESR1、MMP9、TGFB1和NFKB1,其中TNF和NFKB1与炎症相关,且关系紧密。见图1。

图1 补骨脂素治疗骨关节炎PPI网络

2.3 共有靶点生物富集与通路分析 PSO治疗OA靶点生物过程显示细胞生物过程于骨和软骨的分化发育(Osteoblast Differentiation and Development)有关,细胞成分主要作用于介导免疫炎症发生发展的髓系白细胞(Myeloid Leukocyte),通过调控类固醇激素合成(Steroid Biosynthetic)的分子功能发挥抗炎作用。见图2。Cytoscape插件ClueGO富集出6个通路,主要包括破骨细胞分化通路(软骨下骨组织的异常改变),IL-17通路,TNF信号通路以及催乳素通路。见图3。

图2 补骨脂素治疗OA靶点生物过程、细胞成分与分子功能结果图

图3 补骨脂素治疗OA靶点的通路富集分析

2.4 病症结合分析 SymMap共有21种含PSO的药物。见表1。14条PSO相关的骨伤科疾病。见表2。PSO对应101条TCM symptom,20条MM symptom,常见词汇Sputum和Pain,7条syndrome。OA(按部位分为髋、膝、脊柱)对应174条TCM symptom,18条MM symptom,常见词汇Pain,46条syndrome。二者取交集后得到6条TCM Syndrome和1条syndrome。见表3。

表1 常见含有补骨脂素化合物的中草药

表2 补骨脂素有关的骨伤科疾病

表3 补骨脂素对症治疗综合征和中医证候

化合物-草药-症状体征图包含71个节点,78条边。结果显示“风”“寒”挟“湿”杂合而为痹(骨关节炎),其中核心药物有骨碎补、蛇床子、独活和补骨脂。见图4。

图4 补骨脂素治疗OA化合物-草药-症状体征图

2.5 细胞实验结果 与空白对照组比较,补骨脂素低浓度组IL-17和核因子κB的扩增倍数有所升高(均P<0.01);补骨脂素中浓度组IL-17和TNF-α有所下降(均P<0.01);补骨脂素高浓度组差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

图5 补骨脂素干预共培养体系mRNA扩增倍数(n=3)

3 讨论

3.1 病症与中草药化合物 补骨脂素又叫补骨脂内酯、制斑素,属呋喃香豆素类,近年研究显示其在骨伤科疾病方面有潜在应用价值。病症结合领域,中医认为补骨脂素主治的OA属于风寒挟湿的痹症。首先,针对疼痛走注不定为特征的行痹,中医认为与“风”有关。风为百病之长,寒湿等常依附风侵犯人体,其中以风寒、风湿最为常见。内因为卫阳不固,腠理空虚。而以肢体骨节疼痛酸困、痛处不移的着痹,中医多认为与“湿”有关。外湿内湿,同气相求,常相互引动,病位主要在肢体、经络、关节。病久不愈,内侵筋骨血脉,复感于邪,累及心肾。针对疼痛较甚,痛有定处,筋骨挛痛的寒痹,中医认为寒则凝塞,不通则痛,主张温经散寒,由于风寒湿痹与炎症疼痛密切相关,现代理论研究提出了津液不归正化,痰湿内蕴的学说,借助西医免疫炎症的具体机制,阐述中医痰湿致病的理论,使“无形之痰”更为直观,中医治法强调温化以去除水湿痰饮。证候学研究更是印证了二者的紧密联系,理法方药环环相扣,浑然天成。另外中医药有着鲜明的辨证论治色彩,东西方文化在证候改观和病因祛除的认知上存在差异,从祛除致病因素的角度,做好鉴别诊断至关重要,而从缓解症状角度出发,不同疾病有时可以存在相似的表征,所以中医又有异病同治的原则[7]。

3.2 疾病与基因 本节我们重点介绍上游的IL-17通路相关基因。

首先,IL-17属于一种重要的炎症介质[8],参与多种炎症反应及自身免疫性疾病的病理过程,下游介导核因子κB等通路,与炎症关系明确。其次,IL-17可诱导滑膜细胞、巨噬细胞、软骨和骨细胞分泌TNF-α等因子,TNF可能与受体结合,由巨噬细胞分泌,通过去磷酸化损害关节炎患者的调节性T细胞(Regulatory T Cells,Treg Cells)能力。上述因子导致关节炎的骤然发作,通过IL-17维持Th17细胞(Helper T Cell 17,Th17 Cell)的数量,形成正反馈,维持慢性炎症状态,刺激多种趋化因子(Chemokines)产生,其中包括CXCL家族和CC家族,CXCL 1、CXCL2、CXCL8和CCL20、CCL2与CCL7。

以上因子将淋巴细胞、巨噬细胞与粒细胞招募到滑膜加重其炎症,骨与软骨大量损伤会导致关节内难逆性变形,IL-17通过诱导可降解胞外基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMP)参与此过程。破骨细胞通过碳酸酐酶酸化,帮助骨基质溶解成为水、钙离子和其他物质。质子泵以高浓度梯度泵送氢离子,特化的液泡ATP酶能够释放多种水解酶,比如MMP和组织蛋白酶,以消解基质,尤其是软骨下骨基质的有机成分。其中MMP9由破骨细胞表达,与骨微环境有关,是破骨细胞迁移所必需的一种强大明胶酶。破骨细胞分化受到其护骨因子(Osteoprotegerin,OPG)抑制,它由成骨细胞产生并与核因子κB受体活化因子配体(Receptor Activator for NF-κB Ligand,RANKL)结合,阻止与RANK的作用。基于以上机制,IL-17既可增强炎症,又能刺激破骨细胞分化导致骨与软骨的异常改变,如破骨细胞数量减少、骨硬化及其吸收减少[30]。

此外IL-17与TNF-α等协同放大其炎症效应,其中与TNF-α配合形成正反馈环路,加重局部反应,关节炎患者血清和关节液中IL-17显著升高,IL-17是炎症反应和免疫偏移的重要调节因子,可促进TNF-α等炎症介质的分泌,破坏软骨稳态,促进滑膜浸润,与关节炎严重程度成正比[10]。IL-17不仅反映全身炎症状态,同时调控关节内局部炎性微环境。二者间的交互传递极有可能刺激下游靶向核因子κB通路,而作为促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase,MAPKs)信号级联,其过度激活可加剧关节软骨结构及功能障碍与软骨下骨重塑异常[12]。最后IL-17可通过环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)诱导前列腺素扩血管作用,促进炎症细胞进入病变部位,吞噬免疫复合物,释放溶酶体,包括胶原酶和中性蛋白酶,破坏胶原弹力纤维,使滑膜表面及关节软骨损伤[9]。IL-17还可以诱导RANKL表达,促使破骨细胞分化,RANKL是TNF家族成员,基因敲除小鼠可表现出骨硬化以及破骨细胞缺失的表型,RANKL通过RANK激活核因子κB,近年开发的RANKL抑制剂(地舒单抗)在预防骨质疏松,抑制关节炎性病变上也显示出了良好前景[11]。

另外部分基因从不同角度干预病程,乙酰胆碱酯酶(Acetylcholine Esterase,ACE)通过快速水解释放到突触间隙中的乙酰胆碱终止神经肌肉接头处的信号转导,从而调节免疫炎症反应[13]。单胺氧化酶A(Monoamine Oxidase A,MAOA)优先氧化生物胺,其代谢(合成、储存、释放和灭活)异常是导致疼痛的主要原因。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)可使组织免受活性氧中间体毒害,OA中氧化应激可致滑膜炎症和局部关节内病变[14]。

最后我们尝试解释男女性别分布差异原因,高雌激素水平所致疾病的女性,及肥胖、药物等因素所致男性雌化的患者,OA临床症状更严重。通过对OA患者临床特点及中医证型分布流行病学调查研究发现,无论何种中医证型,一般女性多于男性,提示雌激素在OA病理进程中发挥作用[15-16,29]。不同性别患者在疼痛、滑膜炎症、骨赘形成、软骨退变以及软骨下骨硬化方面存在差异。澳大利亚一项研究显示女性患者软骨损失率更高,差异在40岁时显现,并随年龄增长越发明显[17]。动物研究表明雌性大鼠比雄性滑膜炎症、软骨破坏和软骨下骨质退化表现更严重,对刺激更敏感,滑膜周围巨噬细胞浸润更广泛,这是女性疼痛程度更高的原因[18-19]。与男性OA软骨细胞相比,女性OA细胞雌激素受体表达较高,相关白细胞介素mRNA水平更高[20]。研究显示PSO与雌激素受体结合,具有植物类雌激素样作用,发挥抗炎作用,该效应可被雌激素受体抑制剂逆转[21-22]。但是考虑疾病在性别分布上的差异,参考类固醇激素代谢及负反馈调节,我们提出了PSO可能存在类雌激素样的作用,而非雌激素本身的假设,同时我们猜想PSO的类雌激素样作用,与雌激素本身存在明显不同,它可与雌激素竞争受体,同时加速了雌激素向糖皮质激素方向转化,发挥抗炎作用。实验研究也显示中等浓度补骨脂素的确有效降低OA患者软骨-滑膜细胞共培养体系IL-17和TNF-α的水平。

3.3 疾病与通路 骨细胞和破骨细胞的综合作用在维持OA患者软骨下骨量方面发挥重要作用。从骨软骨交界处形成“骨-软骨-钙化软骨”的三明治结构可以发现骨质硬化、纤维化与疏松并存,提示骨代谢异常,双向软骨病理性钙化始于软骨表面纤维化区域,有研究发现补骨脂素可以增加骨密度,用于治疗骨质疏松和OA软骨下骨组织流失,同时抑制软骨病理性钙化,以维持正常骨组织生理结构,体现了药物干预后机体的自我调节能力增强。通路富集还显示催乳素途径和利什曼病较显著,二者分别对应类风湿性关节炎和原虫性关节炎;脾肾阳虚的溃疡性结肠炎患者,常出现五更泄泻,四神丸是治疗本病的经典方剂,但是与OA关系不紧密,并非研究重点。本节着重将其和IL-17炎症通路关联进行分析。

再吸收的骨表面可发现破骨细胞,它是一种大的多核细胞,可有几十个细胞核,特点为粗面内质网稀疏,高尔基体广泛,主要表达破骨细胞蛋白[23]。骨骼中的破骨细胞位于骨表面凹坑的豪息泼氏陷窝(Howship Lacuna)。破骨细胞胞质具有均匀泡沫样外观,这利于液泡填充酸性磷酸酶溶酶体。骨吸收活跃部位,破骨细胞形成广泛折叠或起皱的专有边界,通过增加细胞膜表面积来分泌和吸收区室内容物,促进骨的去除。另外分泌酸和胶原酶,在分子水平上消解吸收水合蛋白与矿物质,破骨细胞影响骨基质再吸收、无机成分溶解及骨基质有机成分消化,能够将氢离子泵入亚破骨细胞室制造酸性微环境,增加矿物质溶解度,致使矿物质释放入破骨细胞胞质,最终转运至邻近毛细血管。矿物质去除后,胶原酶和明胶酶被分泌到亚破骨细胞隔室中,消化、降解、脱钙基质胶原蛋白与有机成分,其产物在褶皱边缘被破骨细胞吞噬。具有吞噬特性可以认定其属于单核吞噬细胞系统的一部分,激素与细胞因子可调控其活性。

IL-17属于前炎症介质,调节炎症反应和免疫偏倚,含6个家族成员与5种受体[24]。IL-17来源于活化的肥大细胞和Th17细胞,通过血管浸润关节滑膜。软骨细胞及成纤维细胞样滑膜细胞表面均存在IL-17受体[25]。研究表明OA进程中T细胞直接对软骨和成纤维细胞膜抗原产生细胞免疫反应。关节炎患者的血清和滑液中IL-17水平较对照组显著升高,其能够抑制软骨细胞合成蛋白多糖,促进MMPs产生,与影像学呈现正相关,不仅如此,部分人群中基因IL-17多态性与关节炎发展的易感性相关[26-27]。作为前体,IL-17可通过核因子κB通路引发炎症反应,IL-17通过与细胞表面的IL-17受体特异性结合,激活激酶引起磷酸化[28]。与空白对照组比较,中等浓度补骨脂素可以使OA患者软骨-滑膜细胞共培养体系中的IL-17、TNF-α显著下降,对于抑制OA症进展具有重要意义,另外核因子κB无显著变化,仍需扩大样本做进一步验证。

总之,上述细胞实验结果和分析符合中等剂量补骨脂素治疗OA的网络药理学预测结果,为进一步研究提供了有力依据。

利益冲突声明:本研究不涉及利益冲突。