川陈皮素通过激活SIRT1/FOXO3a信号来减轻肾缺血再灌注损伤

曹 雯 徐玉祥 范 丽 郭 洁 李 江 张九芝

(1 西安市中医医院,陕西中医药大学西安附属医院肾病科,西安,710077; 2 陕西中医药大学基础医学院,咸阳,712046; 3 西电集团医院肾病科,西安,710077)

肾脏缺血再灌注损伤(Renal Ischemia Reperfusion Injury,RIRI)是指肾脏缺血并恢复血液供应后引起的一系列肾脏损伤,可导致肾功能障碍[1-2]。在缺血后,再灌注触发了一系列的病理生理级联反应,包括细胞内Ca2+的释放、自由基和活性氧的过度产生、中性粒细胞的募集,这一系列反应加速了细胞损伤[3-4]。因此,抑制氧化应激和炎症是减轻RIRI的有效途径。川陈皮素(Nobiletin,NOB)是一种主要存在于柑橘类水果中的多甲氧基黄酮,具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗阿尔茨海默病和帕金森病等活性[5-7]。据报道,NOB对脑缺血具有神经保护作用,其作用机制可能与上调核因子红系2相关因子2(Nuclear Factor Erythroid 2-related Factor 2,Nrf2)和血红素氧合酶1(Heme Oxygenase-1,HO-1),下调核因子κB表达有关[5]。NOB通过恢复受损的自噬流量来减轻大鼠急性心肌梗死后的不良心脏重构[8]。此外,NOB通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase/Protein Kinase B,PI3K/AKT)信号通路减轻RIRI[9]。NOB通过抑制炎症介质和调节诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)-内皮型一氧化氮合酶(Endothelial Nitric Oxide Synthase,eNOS)表达对大鼠RIRI发挥保护作用[10]。上述结果说明NOB对RIRI具有保护作用,然而,具体的分子机制尚不清楚。

多条细胞信号通路参与了RIRI的发生发展[11-12]。组蛋白去乙酰化酶沉默信息调节因子1(Silent Information Regulator 1,SIRT1)是一种重要的代谢传感器,可对细胞压力、饥饿和热量限制作出反应[13]。SIRT1的激活促进了调节线粒体生物发生的基因转录,从而维持能量和代谢稳态[14]。据报道,SIRT1是许多植物黄酮类化合物的主要靶点[15]。此类化学物质对SIRT1的激活可调节线粒体生物发生和线粒体自噬。此外,SIRT1使叉头框蛋白O(Forkhead Box Protein O,FOXO)家族的成员(包括FOXO3a)脱乙酰化并影响其下游自噬途径[16]。研究显示,SIRT1及其下游自噬信号调节缺血再灌注诱导的损伤[17]。最近,DUSABIMANA等[18]报道,NOB通过激活SIRT1/FOXO3a介导的自噬和线粒体生物发生来减轻肝脏缺血再灌注损伤。然而,目前尚不清楚NOB在RIRI中的可能作用机制。因此,本研究旨在揭示NOB是否通过激活SIRT-1/FOXO3a来减轻RIRI。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 40只8周龄雄性无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级Balb/c小鼠购自陕西医药控股集团生物制品有限公司[SCXK(陕)2018-001],体质量20～25 g。将小鼠饲养在标准SPF级环境下:恒温(23±2)℃、恒湿(60±10)%和12 h光暗循环照明。饲养期间不限制饮食和饮水。所有小鼠预适应饲养1周后进行实验。本研究已获得西安市中医医院伦理委员会的批准(伦理审批号:2018XZYYD015),所有动物实验操作均按照动物福利伦理要求执行。

1.1.2 药物 川陈皮素(纯度:98.25%,MedChemExpress公司,美国,批号:HY-N0155)。

1.1.3 试剂与仪器 苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin,HE)染色试剂(批号:G1120)、天狼星红染色试剂(批号:G1471)均购自北京索莱宝科技有限公司。血清肌酐(Serum Creatinine,Cr,批号:C011-2-1)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN,批号:C013-1-1)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD,批号:A001-3-2)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-Px,批号:A005-1-2)和丙二醛(Malondildehyde,MDA,批号:A003-1-2)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。TUNEL试剂盒(Roche,瑞士,批号:11684817910),RIPA裂解液(碧云天生物技术研究所,批号:P0013B)。Pierce BCA蛋白分析试剂盒(批号:23225)、Trizol试剂(批号:10296010)均购自美国Thermo Fisher Science。SIRT1(批号:ab110304)、FOXO3a(批号:ab109629)、抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2关联X蛋白(BCL2-Associated X,Bax)(批号:ab32503)、抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2(B-cell Lymphoma-2,Bcl-2)(批号:ab182858)、微管相关蛋白轻链3(Light Chain-3,LC3)(批号:ab192890)、p62(批号:ab211324)、β-actin(批号:ab8227)、一抗及辣根过氧化物酶偶联的二抗(批号:ab205719)均购自英国Abcam。高容量cDNA反转录试剂盒(批号:4374967)、Power SYBR® Green Master mix(批号:4367659)、StepOneTMReal-Time PCR System(批号:4376357)均购自美国Applied Biosystem。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分组及处理 NOB和SIRT1抑制剂EX527均使用0.1%二甲基亚砜溶解。将小鼠分为5组:假手术组、模型组、NOB组、EX527组、NOB+EX527组,每组6只。在建模前24 h,假手术组和模型组小鼠腹腔注射200 μL 0.1%二甲基亚砜溶剂,NOB组小鼠腹腔注射200 μLNOB(50 mg/kg),EX527组小鼠腹腔注射200 μL的SIRT1抑制剂EX527(5 mg/kg),NOB+EX527组小鼠腹腔注射100 μLNOB(50 mg/kg)和100 μL EX527(5 mg/kg)。

1.2.2 RIRI小鼠模型的建立 术前对小鼠禁食禁水处理24 h,小鼠腹腔注射75 mg/kg的戊巴比妥钠麻醉。备皮及碘伏消毒后,双侧背部入路切口,分离出小鼠左侧肾脏,用无损伤显微血管夹夹住左肾动静脉,阻断左肾血流。然后游离右侧肾脏,结扎肾蒂并切除右侧肾脏,缝合皮肤切口。左侧肾脏缺血40 min后肾脏表面变成黑红色,然后松开左肾血管夹恢复左肾血液灌注,并缝合伤口。假手术组(Sham)小鼠仅开腹但不阻断肾脏血流。

1.2.3 血清Cr和BUN水平的检测 建模24 h后小鼠眼眶后静脉丛取血,室温下1 000×g离心15 min,取上清液。按照试剂盒的说明检测血清中Cr和BUN的水平。

1.2.4 肾脏组织中氧化应激生物标志物的检测 取血后断头处死小鼠并分离左肾,磷酸盐缓冲液(Phosphate-buffered Saline,PBS)冲洗,将一部分肾组织与100 mmol/L的trisPBS混合并制备匀浆,4 ℃下12 000 r/min离心10 min。按照试剂盒的说明检测SOD、GSH-Px和MDA含量。

1.2.5 组织病理学分析 分离左肾后,将一部分肾组织用10%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切成5 μm切片,通过HE染色观察肾脏结构和形态学改变。天狼星红染色检测胶原沉积,通过分析肾脏切片中红色染色面积的百分比来计算纤维化面积。

1.2.6 细胞凋亡检测 将小鼠肾组织置于4%多聚甲醛中固定24 h。常规脱水、透明、石蜡包埋、切成5 μm石蜡切片。脱蜡水合后,在PBS中漂洗3次,5 min/次,切片用透析液(0.1%Triton X-100和0.1%柠檬酸钠)在4 ℃孵育10 min,在PBS中洗涤漂洗3次,5 min/次,然后用50 μL的脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP Nick-end Labeling,TUNEL)试剂在37 ℃下避光孵育60 min。用PBS漂洗3次,5 min/次,然后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色细胞核2 min。随机取6个视野计数100个细胞中的TUNEL阳性凋亡细胞数。TUNEL阳性率=TUNEL阳性细胞数/计数细胞总数×100%。

1.2.7 蛋白质免疫印迹法检测 小鼠肾组织在含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀法(Radioimmunoprecipitation Assay,RIPA)缓冲液中在冰上裂解30 min。在4 ℃下15 000×g离心15 min后,将上清液用Pierce BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白浓度。用10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白裂解产物并转移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上。5%脱脂牛奶室温封闭1 h后,将膜与抗SIRT1(1∶1 000稀释)、FOXO3a(1∶1 000稀释)、抗凋亡蛋白Bax(1∶3 000稀释)、抗凋亡蛋白Bcl-2(1∶2 000稀释)、微管相关蛋白LC3(1∶2 000稀释)、p62(1∶3 000稀释)和β-actin(1∶1 000稀释)在4 ℃下过夜孵育。然后将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗(1∶1 000)室温孵育1 h。之后使用电化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)试剂显影,β-actin用作内部对照。采用Image J软件对相关蛋白表达进行定量分析。

1.2.8 实时荧光定量PCR检测 采用Trizol法提取肾组织总RNA。根据高容量cDNA反转录试剂盒合成cDNA。使用Power SYBR® Green Master mix和StepOneTMReal-Time PCR System进行实时荧光定量PCR。反应条件:95 ℃预变性4 min,95 ℃变性60 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸30 s,40个循环。以β-actin为内参,采用2-△△Ct法计算相对表达量。引物序列如下:SIRT1,上游为5′-ACCAAATCGTTACATATTCC-3′,下游为5′-CAAGGGTTCTTCTAAACTTG-3′。FOXO3a,上游为5′-CTGTCCTATGCCGACCTGATCAC-3′,下游为5′-CATTCTGAACGCGCATGAAGCG-3′。β-actin,上游为5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′,下游为5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′。

2 结果

2.1 NOB减轻RIRI小鼠肾组织病变 HE染色显示,假手术组小鼠肾组织形态正常。模型组小鼠肾组织出现胞浆空泡、血管变性、炎症细胞浸润、肾小管细胞肿胀和肾小管坏死等病变。NOB组小鼠肾组织病变较模型组明显减轻。NOB+EX527组小鼠肾组织病变较NOB组明显加重。见图1。

微波介质材料的研究主要采用谐振法和网络参数法测量被测物品的介电常数.常见易燃有机液体与水的介电常数差异较大，如表1所示.

图1 各组小鼠肾组织比较(HE染色,×400)

天狼星红染色显示,红色染色区域为胶原,代表纤维化;黄色染色区域为肌肉纤维。假手术组肾组织红色染色面积较小。模型组肾组织红色染色面积较假手术组增多。NOB组肾组织红色染色面积较模型组减少。NOB+EX527组肾组织红色染色面积较EX527组减少。定量分析显示,各组小鼠肾脏纤维化面积差异有统计学意义(F=288.155,P<0.001)。与假手术组比较,模型组小鼠肾脏纤维化面积显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,NOB组肾脏纤维化面积显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与NOB组比较,NOB+EX527组肾脏纤维化面积显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 各组小鼠肾组织纤维化

2.2 NOB降低RIRI小鼠血清Cr和BUN水平 各组小鼠血清Cr和BUN水平差异有统计学意义(F=334.727,P<0.001;F=526.795,P<0.001)。与假手术组比较,模型组血清Cr和BUN水平显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较,NOB组血清Cr和BUN水平显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。此外,与NOB组比较,NOB+EX527组血清Cr和BUN水平显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠血清Cr和BUN水平

2.3 NOB提高RIRI小鼠肾组织抗氧化活性 各组小鼠肾组织SOD、GSH-Px和MDA水平差异有统计学意义(F=36.757,P<0.001;F=188.613,P<0.001;F=169.249,P<0.001)。与假手术组比较,模型组肾组织SOD和GSH-Px水平显著降低,而MDA升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较,NOB组肾组织SOD和GSH-Px水平显著升高,而MDA降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与NOB组比较,NOB+EX527组肾组织SOD和GSH-Px水平显著降低,而MDA升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠肾组织中SOD、GSH-Px和MDA比较

2.4 NOB抑制RIRI小鼠肾组织中的细胞凋亡 与假手术组比较,模型组TUNEL阳性率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,NOB组TUNEL阳性率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。此外,与NOB组比较,NOB+EX527组TUNEL阳性率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。假手术组肾组织TUNEL阳性染色(绿色荧光)较少。模型组肾组织TUNEL阳性染色较假手术组增多。NOB组肾组织TUNEL阳性染色较模型组减少。NOB+EX527组肾组织TUNEL阳性染色较EX527组减少。见图3。

图3 各组小鼠肾组织TUNEL阳性率比较

与假手术组比较,模型组Bax蛋白相对表达量显著升高,而Bcl-2显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较,NOB组Bax蛋白相对表达量显著降低,而Bcl-2显著升高(均P<0.05)。此外,与NOB组比较,NOB+EX527组Bax蛋白相对表达量显著升高,而Bcl-2显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图4。

图4 各组小鼠肾组织中Bax和Bcl-2蛋白表达比较

图5 各组小鼠肾组织中SIRT1和FOXO3a的mRNA表达水平比较

与假手术组比较,模型组SIRT1、FOXO3a和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相对表达量显著降低,而p62显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较,NOB组SIRT1、FOXO3a和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相对表达量显著升高,而p62显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。此外,与NOB组比较,NOB+EX527组SIRT1、FOXO3a和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相对表达量显著降低,而p62显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图6。

图6 各组小鼠肾组织中SIRT1、FOXO3a、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62的蛋白表达水平比较

3 讨论

缺血再灌注可导致肾脏出现强烈炎症和氧化应激反应,引起肾功能丧失[19]。因此,抑制过度的炎症和氧化应激是预防和治疗RIRI的关键。天然植物药在抗炎和抗氧化中具有良好效果。NOB的抗炎、抗氧化活性已经被广泛报道[5-7]。本研究中,HE染色和天狼星红染色显示,NOB减轻了RIRI小鼠肾组织病变并抑制了肾脏纤维化。Cr和BUN在RIRI动物中升高[20],提示肾功能发生障碍,另外,本研究表明NOB降低了RIRI小鼠血清Cr和BUN水平。与LIU等[9]研究报道,NOB降低了RIRI大鼠血清Cr和BUN水平,本研究与该研究结果一致。

肾细胞对氧分压的变化非常敏感,其内源性抗氧化防御强烈依赖于高浓度抗氧化酶的存在,如SOD、CAT和GSH-Px[21]。研究表明,在动物模型中,即使延迟给予自由基清除剂也能减轻RIRI。活性氧的过量产生破坏了内源性抗氧化防御,导致ATP耗竭,膜磷脂蛋白酶活性升高,细胞内Ca2+水平升高,线粒体氧化磷酸化改变[22]。此外,氧自由基增加了损伤膜的脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA的氧化损伤[23]。在本研究中,RIRI小鼠肾组织中抗氧化酶SOD和GSH-Px活性降低,而脂质过氧化产物MDA水平升高。NOB有助于抗氧化酶活性的恢复和抑制脂质过氧化。ZHANG等[5]研究也显示NOB可显著增加脑缺血大鼠脑组织中Nrf2、HO-1、SOD1和GSH的表达。GÜVENÇ等[10]研究显示NOB降低了RIRI大鼠肾组织中MDA、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6水平。这些结果与本研究一致。充分证实NOB对RIRI小鼠具有良好的抗氧化作用。

此外,线粒体功能障碍是IR损伤的一个主要特征,因为线粒体对能量稳态非常重要,并直接介导氧化应激和细胞死亡[24]。过度的氧化应激可导致线粒体功能障碍并启动细胞凋亡[25]。在本研究中,NOB减轻了RIRI小鼠的肾细胞凋亡,与LIU等[9]研究结果一致。这些结果提示,NOB可能通过抑制氧化应激,从而减轻了RIRI小鼠线粒体功能障碍以及随后的细胞凋亡。

增加自噬和线粒体功能是减轻IR损伤的一种有前途的治疗策略。SIRT1/FOXO3a信号通路是一条重要的自噬调节通路[18]。SIRT1在细胞能量代谢、衰老、自噬等许多生理过程中起着重要作用[26]。FOXO家族调节各种器官的自噬,通过激活小鼠肝脏和原代肝细胞中的FOXO3a表达增加自噬相关基因的表达[27]。FOXO3a活性受SIRT1的调节[28]。LC3和p62是2种主要的自噬调节蛋白。自噬时,胞浆型LC3(LC3Ⅰ)会发生酶解并转变为自噬体膜型(LC3Ⅱ),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的大小可反映自噬水平的强弱[29-30]。p62是一种泛素结合蛋白,自噬发生后,p62与泛素化蛋白质结合,并在自噬溶酶体内降解,因此,p62的水平与自噬负相关[29-30]。SIRT1/FOXO3a信号通路对自噬的调控作用主要是通过调节LC3、p62等自噬相关蛋白来实现的。天然化合物(二氢杨梅素或小檗碱)通过增强SIRT1/FOXO3a诱导的自噬途径来减轻肝脏IR损伤,而抑制FOXO3a或SIRT1的表达减弱了这些化合物的保护作用[31-32]。本研究显示,NOB激活了RIRI小鼠肾组织SIRT1/FOXO3a信号通路并增强了肾细胞自噬。WU等[8]研究也显示NOB增强了急性心肌梗死大鼠心肌组织中的自噬通量。另外,使用SIRT1抑制剂EX527处理来抑制小鼠体内SIRT1的表达,研究表明,SIRT1抑制剂EX527逆转了NOB对RIRI小鼠的肾保护作用。因此,上述结果提示NOB通过激活SIRT-1/FOXO3a信号通路介导的自噬来减轻RIRI。

综上所述,本研究表明NOB通过激活SIRT1/FOXO3a信号通路介导的自噬来减轻RIRI。本研究将有助于揭示NOB在治疗RIRI中的具体机制,并且为RIRI防治药物的开发提供参考。

利益冲突声明:无。