金黄色葡萄球菌噬菌体生物学特性研究

赵翠 赵效南 闫超 胡明 张庆 骆延波 刘玉庆

摘要：本研究利用分离自生鲜牛乳样品中的金黄色葡萄球菌作为宿主菌，从污水中分离得到一株噬菌体，命名为RPCSa20091。对其生物学特性研究结果显示，该噬菌体属于微球形有尾目噬菌体；宿主谱较宽，裂解率为81.8%；在40℃条件下噬菌体相对稳定，45℃条件下不生长，pH值在3-10时较稳定，pH值在1-2和11-12时噬菌体完全失活；其最佳感染复数为0.1；潜伏期为15 min．裂解周期为75 min。本研究结果为金黄色葡萄球菌噬菌体用于奶牛乳腺炎的治疗提供了理论基础。

关键词：金黄色葡萄球菌；噬菌体；生物学特性

中图分类号：S852.61+1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023）02-0135-05

金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜共患病原菌，可导致人类和动物的多种疾病，例如败血症、心内膜炎、乳腺炎以及脑膜炎等，严重威胁公共健康。同时金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎最常见的病原体之一。中国约有10%-40％奶牛乳腺炎是由金黄色葡萄球菌引起，受感染的动物通常将金黄色葡萄球菌排入到乳汁中。目前治疗金黄色葡萄球菌感染主要依靠抗生素，但金黄色葡萄球菌可以获得赋予对不同抗生素耐药性的基因。最广泛且常见的耐药菌株是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，对所有B-内酰胺类药物耐药。尽管世界各国科学家在乳腺炎的病原、疫苗研发等方面取得大量研究成果，但目前还没有很好的措施能够达到满意的防治效果。噬菌体作为一种寄生在细菌中的病毒，能够有效裂解细菌，近年来被认为具有替代抗生素治疗金黄色葡萄球菌的潜在价值。

噬菌体是一种可以杀死目标宿主细菌的病毒，能够将遗传物质注入细菌中并在其内复制。与抗生素相比，噬菌体具有多种优势，例如，不会破坏宿主的正常微生物菌群、具有很强的宿主特异性、只在感染部位复制且无严重副作用，而且可以与抗生素进行协同治疗以达到更好的治疗效果，是一种理想的抗生素替代品。目前已经鉴定出200多种裂解性金黄色葡萄球菌噬菌体。同时金黄色葡萄球菌噬菌体体内和体外治疗试验结果表明其具有有效的抗菌活性。皮下注射金黄色葡萄球菌噬菌体可预防家兔和小鼠脓肿的形成。然而金黄色葡萄球菌噬菌体的研究和治疗还有限，仍需要更多的科研探索来支持。

本研究以从生鲜牛奶样品中分离的金黄色葡萄球菌为宿主进行噬菌体分离鉴定，对筛选的噬菌体进行生物学特性分析，以期为金黄色葡萄球菌噬菌体的研究和后续的治疗防控提供一定的理论基础。

1材料与方法

1.1试验菌株

金黄色葡萄球菌分离自生鲜牛乳样品，由山东省农业科学院畜牧兽医研究所公共卫生研究室提供。

1.2噬菌体的分离与纯化

从济南市某奶牛场污水处理池内采集20 mL污水样品，4 000xg离心15 min后，取上清，用0.22 um滤膜过滤除菌后置于4℃备用。取生长到指数期的金黄色葡萄球菌500 uL与500 uL滤液混合，置于37℃恒温培养箱中，200 r/min培养16 h。混合物4 000xg、4℃离心15 min，取0.1mL上清液与0.1 mL金黄色葡萄球菌在3 mL LB（0.7%瓊脂）软琼脂中混合均匀并倾倒平板，然后用1.5%琼脂覆盖在LB培养基表面，37℃培养过夜后，用注射器针从平板中挑取边缘整齐、型体较大、色泽透亮的噬菌体斑块接种到宿主菌培养液中，37℃恒温摇床中培养3h后，过滤取上清，取10倍倍比稀释的上清稀释液与宿主菌混匀吸附后，采用双层琼脂平板法培养，重复3次以上，直至在同一个平板上噬菌斑形态大小基本一致，即得到纯的噬菌体。

1.3噬菌体的电镜观察

噬菌体原液经4 000×g、4℃离心40 min获得效价为10 pfu/mL的噬菌体浓缩液，并将其悬浮在2％戊二醛中。静置30 min后，4 000xg离心40 min，然后将沉淀悬浮在PBS中。将噬菌体样品滴加到铜网上吸附10 min，用滤纸小心吸除噬菌体溶液。滴加1%乙酸双氧轴溶液5 uL，染色2 min后吸除染液，室温晾干后用透射电镜观察。

1.4噬菌体宿主谱测定

将121株金黄色葡萄球菌分离株培养至指数生长期，取100 uL菌液与100 uL噬菌体混匀后，37℃孵育15 min，然后通过双层平板法观察有无噬菌斑形成。

1.5噬菌体稳定性

参照参考文献[14]进行。噬菌体热稳定性测定：将噬菌体悬浮液（10 pfu/mL）在不同温度下（4、37、50、60、70℃）孵育1h；噬菌体最适pH值测定：将噬菌体悬浮液（10 pfu/mL）放置在不同pH值（1-12）的SM缓冲液中，37℃孵育1h。噬菌体效价通过双层平板法测定。

1.6噬菌体最佳感染复数（MOI）的测定

参照Li等的方法。首先将宿主菌浓度调整为10 cfu/mL，然后将不同稀释浓度的噬菌体按照不同的感染复数（MOI= 0.001、0.01、0.1、1、10）与等体积的菌液混合，37℃、200 r/min振荡培养4h。将混合物4 000xg离心10 min后，通过双层平板法测定噬菌体效价，效价最高的即为最佳感染复数。

1.7噬菌体一步生长曲线的测定

参照Pajunen等的方法。将500 uL噬菌体（10 pfu/mL）和500 uL宿主菌（10 cfu/mL）在37℃条件下培养5min。将混合物以13 000xg离心1 min，弃上清，将沉淀物悬浮在3 mL LB培养液中，37℃、100 r/min振荡培养。每15 min取样500 uL，连续取样120 min，使用双层琼脂平板法测定噬菌体的效价，并绘制噬菌体生长曲线。试验重复3次。

1.8数据处理与分析

本试验所有数据均使用统计分析系统SPSS 20.0进行分析，使用Graphpad prism 5 software（Graphpad Software Inc.，San Diego，CA）作图。

2结果与分析

2.1噬菌体的分离与纯化

从奶牛场污水样品中分离到一株金黄色葡萄球菌噬菌体，纯化3代后，获得直径大小为1-2mm、边缘整齐透亮的噬菌斑（图1），命名为RPC-Sa20091。

2.2噬菌体的电镜观察

透射电镜观察结果（图2）发现，噬菌体RPC-Sa20091为微球形有尾目噬菌体，由清晰的正二十面体头部和细长的尾部组成。头部直径约为56-59 nm，整个噬菌体长度约在194-294 nm之间。

2.3噬菌体宿主谱测定

结果显示，噬菌体RPCSa20091能在99株金黄色葡萄球菌的双层琼脂平板上产生噬菌斑，表明噬菌体能够裂解99株金黄色葡萄球菌，具有很宽的宿主谱，其裂解率为81.8％。

2.4噬菌体稳定性

噬菌体RPCSa20091的热稳定性结果显示，在40℃条件下噬菌体相对稳定，在45℃条件下不生长（图3A）。噬菌体RPCSa20091的酸碱稳定性结果显示，当pH值在3-10时，噬菌体比较稳定，但当pH值在1-2和11-12时完全失活（图3B）。

2.5噬菌体最佳感染复数

噬菌体RPCSa20091最佳感染复数测定结果（图4）显示，当MOI为0.1时，噬菌体效价最高。

2.6噬菌体一步生长曲线

噬菌体RPCSa20091一步生长曲线结果（图5）显示，噬菌体具有较短的潜伏期，约为15 min，裂解周期为75 min，裂解量为10 pfu/mL。

3讨论与结论

奶牛乳腺炎被认为是所有已知动物疾病中最昂贵的疾病，已被确定是影响奶牛健康最主要的疾病，可带来巨大的经济损失。噬菌体疗法为控制由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎提供了一种新的方法。本研究以生鲜牛乳中分离的金黄色葡萄球菌为宿主菌，从奶牛场污水中分离纯化得到一株噬菌体RPCSa20091，继而对其进行一系列生物学特性分析。

通过电镜观察得知噬菌体RPCSa20091为长尾噬菌体，与报道的大多数已知的金黄色葡萄球菌噬菌体属于长尾噬菌体相吻合，但王一帆等报道的噬菌体P42为短尾噬菌体，并且只能裂解宿主菌，宿主谱较窄。本研究中，噬菌體RPCSa20091具有较宽的宿主谱（81.8%），能够裂解与奶牛相关的金黄色葡萄球菌，表明其具有潜在的噬菌体治疗作用。噬菌体MSA6同样具有宽的宿主谱，能够裂解与牛乳腺炎相关的致病葡萄球菌以及与人类感染相关的耐抗生素金黄色葡萄球菌。噬菌体RPCSa20091稳定性结果显示，在40℃条件下相对稳定，但在45℃条件下基本上不生长。蔡天舒等报道的噬菌体qdsa001在60℃条件下仍具有良好的耐受性，表明噬菌体RPCSa20091耐热性较差。噬菌体RPCSa20091在pH值为3-10范围内稳定存在，表明该噬菌体对酸碱溶液有一定的抵抗力，可以通过口服途径进行治疗。通过研究噬菌体RPCSa20091的一步生长曲线得知，该噬菌体与王倩等分离报道的噬菌体有着短潜伏期、长爆发期及高裂解量的优点一致。

综之，噬菌体RPCSa20091具有高效裂解活性和较宽的宿主谱，通过了解其生物学特性，为用于由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎及相关疾病的预防和治疗奠定了基础。