哈茨木霉施用方式对烟草生长、黑胫病防治及诱导抗性的影响

匡志豪 王典 云菲 王兆双 韩梦园 张幸博 王景 殷全玉

摘要：为探究生防菌株哈茨木霉对烟草生长促进和黑胫病防治效果的最佳施用方式，本试验在温室盆栽条件下分析了哈茨木霉浸种、灌根和叶面喷施3种施用方式对烟草生物学性状、生理特性、烟草黑胫病防治效果以及诱导抗性的影响。结果表明，哈茨木霉浸种、灌根、叶面喷施处理对烟草地上部和地下部生物学性状及生物量积累均具有显著促进作用，整体表现为灌根>浸种>叶面喷施。哈茨木霉对烟株叶面积促进效果高于株高和茎围，移栽后28 d经灌根处理烟株根系更加发达，总根长、根体积、分枝数较对照显著增加，地上部和地下部鲜质量较对照分别增加86.14%和84.16%。灌根处理后烟株硝酸还原酶活性、根系活力、叶绿素含量均随时间推移逐渐升高，在移栽后21 d达到稳定。哈茨木霉定殖量与防御性酶活性和烟草黑胫病防治效果呈正相关关系，经诱导烟草根系POD、PPO、PAL和CAT活性显著升高。各时期灌根处理烟株体内哈茨木霉定殖量均显著高于浸种和叶面喷施处理，烟草黑胫病发病率较对照降低75.00个百分点，病情指数降至13.89。综上可知，移栽期哈茨木霉灌根处理能有效提高烟株生长质量，诱导烟株抗性增强，降低烟草黑胫病发生。

关键词：哈茨木霉；施用方式；生物学性状；生理特性；烟草黑胫病；诱导抗性

中图分类号：S435.72 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023）02-0119-08

烟草是中国重要的经济作物，由于长期连作及过量化肥、农药施用，烟区土壤质量下降、病害发生日益严重、烟叶品质降低，同时对生态环境产生一系列负面影响。烟草黑胫病是由烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）引起的一种土传真菌病害，在中国各烟区普遍发生，严重地块发病率高达75％以上，是危害烟叶生产的主要病害之一，严重影响了烟叶生产的可持续发展。

木霉菌是一类广泛存在于土壤中的拈抗真菌，通过竞争优势、重寄生作用以及诱导植物产生抗性等方式，达到高效、安全、绿色防治效果。王献慧等在花生种植前利用哈茨木霉浸种，有效提高了植株叶片数和侧枝长，显著降低了叶斑病发病率。王依纯等通过棘孢木霉、哈茨木霉和拟康氏木霉灌根，均提高了黄瓜幼苗叶绿素含量、硝酸还原酶活性以及根系活力，促进幼苗生长。张敏等采用绿色木霉叶面喷施玉米，对株高、根长均有促进效果，根活力、过氧化物酶活性及叶绿素含量较对照显著升高。木霉制剂对植物促生防病效果随使用方式不同存在较大差异，如刘峰等利用哈茨木霉浸种、拌土和叶面喷施处理均能促进玉米幼苗生长，其中拌土处理对植株地上部生长性状、根长及生物量积累提高效果更显著。张敏等认为木霉浸种和叶面喷施混合处理能有效增强玉米防御类酶活性，提高对玉米丝黑穗病的防治效果。肖密比较了哈茨木霉菌T2-16孢子悬浮液浸种、灌根以及掺拌基质对西瓜枯萎病的防治效果，其中木霉菌掺拌基质处理下的西瓜过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性提高最显著，防治效果达到60%。

当前，利用木霉菌防治植物病害报道已有很多，但木霉菌施用方式对烟草的生长、病害防效以及诱导抗性的影响缺乏系统研究。本课题组利用前期筛选出对烟草黑胫病病菌有较强拮抗效果的哈茨木霉菌，研究哈茨木霉浸种、灌根和叶面喷施3种施用方式对烟草生物学性状、生理特性、诱导抗性及烟草黑胫病防治的影响，旨在提高生产中木霉菌剂使用效果，为绿色烟叶生产提供技术支撑。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试烟草品种 K326由河南农业大学烟草学院提供。

1.1.2供试培养基 PDA：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15-20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。燕麦琼脂培养基（OA）：燕麦仁60 g，蔗糖20 g，琼脂8g，蒸馏水1000 mL，pH自然。

1.1.3供试菌株 哈茨木霉CGMCC 23294由中国农业科学院农业微生物菌种保藏中心提供：烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）由河南农业大学烟草学院提供。

1.1.4菌液制备 将哈茨木霉接入PDA平板于（27±1）℃培养5-7 d后，用无菌水冲洗孢子，制成1×10 7 cfu/mL孢子悬浮液备用。将烟草疫霉菌接人燕麦琼脂（OA）培养基，（26±1）℃培养6-7d后，用无菌水冲洗孢子，并调节为1×10cfu/mL孢子悬浮液备用。

1.2试验处理

本试验于2021年6月至10月在河南农业大学许昌校区烟草基地温室大棚内进行，棚内温度28℃，湿度40%。盆栽土壤采用大田耕层土壤，基础土壤肥力：速效钾144.61 mg/kg，速效磷118.89 mg/kg，堿解氮70.50 mg/kg，有机质16.45g／kg，除去杂草和石子后过1 cm×1 cm筛网，按1.83g／kg添加复合肥（N：P2O5：K2O=1：1.5：3），充分混匀，装入内口径20.5 cm、高度13.5 cm的花盆，每盆装土量3 kg。

1.2.1对照处理 将烟草种子表面消毒（质量分数75％乙醇，1 min；30%双氧水，5 min）后，播种于装有已灭菌基质的漂浮育苗盘中培育，总计50株。

1.2.2浸种处理 烟草种子表面消毒后，用哈茨木霉孢子悬浮液浸种处理48 h，无菌水漂洗干净，播种于装有已灭菌基质的漂浮育苗盘中，待烟苗到达成苗期装盆移栽至温室大棚，总计50株。

1.2.3灌根处理 消毒后的烟草种子，采用常规漂浮育苗，待烟苗到达成苗期装盆移栽，利用哈茨木霉孢子悬浮液进行灌根处理。每株烟接种20mL，总计50株。

1.2.4叶面接种处理 烟苗长至成苗期后移栽，移栽当天，将哈茨木霉孢子悬浮液均匀喷施在烟苗叶片上直至叶表面布满一层细微水珠而不滴落为止，每株烟均匀喷施20 mL，总计50株。

哈茨木霉孢子悬浮液灌根与叶面喷施处理时间相同，各处理挑选长势均匀一致烟株同一时间移栽，且移栽方式与后续管理措施保持一致。

1.3测定指标及方法

1.3.1生物学性状测定 移栽后28 d进行生长量指标测定，各处理选取5株，测量株高、茎围、叶片长度和宽度（自上而下第5片叶），计算叶面积（叶面积=0.6345×叶长×叶宽）。将盆内土壤倒出，轻轻抖落根部土壤，用清水反复冲洗干净，吸水纸吸干水分称量地上部和地下部鲜质量：通过EPSON根系扫描仪将根系完整扫描的图像存入计算机，利用WinRHIZO分析总根长、根表面积、平均根直径、根体积及分支数：扫描后的根部同地上部在105℃烘箱杀青15 min后，70℃烘干测干质量及根冠比（地下部鲜质量／地上部鲜质量）。

1.3.2生理生化指标测定 移栽后7、14、21、28d分别采集各处理烟株自上而下第4片叶，避开叶脉，在叶片中部环状切取0.5 g，采用丙酮乙醇提取比色法，测定叶绿素含量；将烟苗挖出，根部清洗干净并吸干水分，称取1.0 g，参照朱秀云等的方法，采用TTC法测根系活力：另外取0.1g烟株根部参照张春秋等的方法，采用活体分光光度法测根系硝酸还原酶活性，各生理指标测定3次重复，每次重复均来自同一烟株。

1.3.3哈茨木霉在烟株体内定殖规律 在移栽后7、14、21、28 d分别取各处理烟株根部、茎基部和叶片各0.1 g混合，每株烟重复取样3次，将混合样品在液氮中冻干研磨成粉，采用生工生物工程（上海）股份有限公司试剂盒进行真菌DNA提取。依照哈茨木霉测序结果根据其rDNA转录间隔区特有保守序列设计引物EFl-728F（5 -CATCGAGAAGITCGAGAAGG-3）和TEFILL Er-ev（5- AACTTGCAGGCAATGTGG -3'）并对其序列进行PCR扩增。PCR反应体系：模板DNA 4.0uL，EFl-728F和TEFILL Erev各1.0 uL，2x TaqPCR Star Mix 25 uL，加ddH2O朴足至50 uLPCR反应程序：94℃预变性4 min；94C变性45 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环：72℃延伸10 min，16℃保存。取40 uL扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，采用ToIoPrep柱式PCR纯化／胶回收试剂盒对目标条带进行纯化，利用超微量分光光度计检测其浓度，取3次结果平均值，各处理重复3次。

1.3.4抗病性及诱导抗性指标测定 各处理烟苗在移栽后28 d，采用灌根接種法，将配制好的烟草疫霉孢子悬浮液（1xl0 5cfu/mL）20 mL均匀接种在烟株根部土壤，14 d后调查发病率，计算病情指数及防治效果，并测定各处理烟株根部过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和过氧化氢酶（CAT）活性，各处理3次重复。

烟草黑胫病分级标准参照中华人民共和国烟草行业标准YC/T 39-1996。

发病率（%）=病株数／调查总株数×100：

病情指数=∑（病级数×该级病株数）／（最高病级数×调查总株数）×100：

防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）／对照病情指数×100。

1.4数据处理

利用Microsoft Excel 2019进行数据处理和图表制作，通过SPSS 25.0在0.05水平上对数据进行差异显著性检验。

2结果与分析

2.1哈茨木霉不同施用方式对烟草生物学性状的影响

2.1.1哈茨木霉不同施用方式对烟草地上部生物学性状的影响 由表1和图1可知，与对照相比，在移栽后28 d，哈茨木霉不同施用方式对烟草地上部生长均具有明显促进作用，以灌根处理对烟草株高和叶面积提高效果最显著，较对照分别增加54.22%和67.42%（P<0.05），显著高于浸种和叶面喷施处理：相比对照处理，3种施用方式对烟株茎围影响均达显著水平，以叶面喷施处理增幅最大，达到23.40%（ P<0.05）。整体来看，哈茨木霉对烟草叶面积促进效果优于茎围和株高。

2.1.2哈茨木霉不同施用方式对烟草地下部生物学性状的影响 由图2和表2可知，3种施用方式对烟草根部各指标表现出不同程度地促进作用，哈茨木霉灌根处理的烟株在移栽后28 d根系更发达，各根系指标均高于浸种和叶面喷施处理。经灌根处理烟株总根长、根表面积、平均根直径、根体积和分支数较对照增加显著，增幅分别达43.21％、62.91%、87.63%、119.79％和80.46％；浸种处理对烟草根系各指标提高也较显著，较对照分别提高28.86％、49.60％、27.84%、85.03%和42.87％；相比对照，叶面喷施处理对烟草根表面积、平均根直径及根体积影响不显著，较对照增加14.02%、4.12％和17.47％。结合烟株地上部发育（表1）可知，哈茨木霉施用方式对烟草地上部和地下部生物学性状影响相同，即灌根>浸种>叶面喷施。

2.1.3哈茨木霉不同施用方式对烟草生物量积累的影响 由表3可知，哈茨木霉浸种、灌根和叶面喷施处理后烟株地上部和地下部生物量积累均高于对照。以灌根处理对烟株生物量积累促进作用最强，其次是浸种处理，叶面喷施效果相对较弱。灌根处理烟株地下部鲜质量、地上部鲜质量、地下部干质量和地上部干质量较对照分别增加84.16％、86.14%、63.29%和64.17%（P<0.05）.浸种处理烟株地上部鲜质量和干质量增幅分别为62.49％和58.35％（P<0.05），与灌根处理间无显著差异。对照、浸种和灌根处理之间烟株根冠比差异不显著，经叶面喷施后烟草根冠比有所下降，说明哈茨木霉能促进烟草地上部和地下部生物量积累，并不能有效提高烟草根冠比。

2.2哈茨木霉施用方式对生理特性的影响

2.2.1哈茨木霉施用方式对烟草根系硝酸还原酶活性和叶片叶绿素含量的影响 由图3可知，叶绿素含量随移栽时间逐渐增加，各时期含量均表现为灌根>浸种>叶面喷施>对照。其中浸种和灌根处理各时期叶绿素含量与对照之间均呈显著差异，最大增幅为33.70%和51.52％（P<0.05），分别出现在移栽后第7天和14天，两处理间差异随时间逐渐减小，在移栽后第28 d浸种与灌根处理之间叶绿素含量无显著差异。移栽后7d葉面喷施与对照间叶绿素含量差异不显著，在第21天，两处理间差值达到最大，相比对照提高21.61％（P<0.05）。

各时期3种施用方式烟草根系硝酸还原酶活性与对照之间均呈显著差异，总体变化趋势与叶绿素相同，各处理硝酸还原酶活性随移栽时间逐渐升高，以灌根处理最高。浸种和灌根处理酶活性在移栽后21 d较对照增幅达到最大，分别为29.54%和55.72％（P<0.05）：叶面喷施处理酶活性在移栽后第14天较对照提高24.77％（P<0.05），移栽后28 d灌根处理烟草根系硝酸还原酶活性最高，浸种与叶面喷施处理之间无显著差异。

2.2.2哈茨木霉施用方式对烟草根系活力的影响 由图4可知，哈茨木霉处理可以不同程度提高烟草根系活力，3种施用方式烟草根系活力随移栽天数呈现先升高后降低的趋势。其中以灌根处理促进作用最显著，峰值出现在移栽后第14天，相较对照增幅最大，达到41.71％（P<0.05）；浸种和叶面喷施处理根系活力峰值均出现在移栽后第21天，较对照分别提高20.35%和12.99％（P<0.05）。随移栽时间延长对照处理烟株根系活力逐渐升高，与各处理间差值呈逐渐缩小趋势，但在移栽后28 d仍显著低于哈茨木霉处理。

2.3不同施用方式下哈茨木霉在烟草体内定殖规律

由图5可知，通过PCR扩增检测，对照处理烟株各时期体内哈茨木霉DNA含量均为零。浸种和灌根处理烟株体内哈茨木霉定殖量随移栽时间延长呈先升高后降低趋势，分别在移栽后第14天和第21天达到最大值，各时期灌根处理烟株体内哈茨木霉定殖量均显著高于浸种和叶面喷施处理：经叶面喷施处理烟株体内哈茨木霉定殖量随时间逐渐减少。

2.4哈茨木霉施用方式对烟草诱导抗性的影响

2.4.1哈茨木霉施用方式对烟草黑胫病拮抗效果的影响 对照处理烟株发病率和病情指数均显著高于哈茨木霉处理，以灌根处理对烟草黑胫病防治效果最显著，达到75.94％，病情指数为13.89（P<0.05）：浸种和叶面喷施处理下烟草黑胫病发病率、病情指数和防治效果差异不显著，两处理防效分别为53.32%和49.48％。

2.4.2哈茨木霉施用方式对烟草诱导抗性的影响 由表5可知，哈茨木霉对烟草根部防御性酶活性具有诱导效应。3种施用方式均有效提高了烟草根部POD活性，但三者之间无显著差异，灌根处理后烟草POD活性较对照增加28.70%（P<0.05），高于浸种和叶面喷施处理。

PPO活性以灌根处理最高，较对照提高71.34%（P<0.05）；浸种与叶面喷施处理之间无显著差异，分别较对照增加33.84％和39.63％（P<0.05）。

浸种处理后烟草根部PAL活性较对照升高5.87％，与对照间无显著差异：灌根和叶面喷施处理能显著提高PAL活性，分别提高66.75%和32.52％（P<0.05）。

浸种和灌根处理对CAT活性促进作用最明显，较对照分别提高80.33％和105.92％（P<0.05），叶面喷施效果显著低于浸种和灌根，与对照之间差异不显著。

综上结果，3种施用方式对烟草根部POD、PPO、PAL和CAT活性均有促进作用，其中以灌根处理对各防御性酶活性诱导效果最显著。POD活性受施用方式影响较小，PAL和CAT活性受施用方式影响最大。在生物胁迫条件下，灌根处理有利于激发烟草根部POD、PPO、PAL和CAT活性，提高烟草诱导抗性。

3讨论与结论

木霉菌作为一种广谱性生防菌，至少对18个属20余种病原真菌和多种病原细菌有拮抗效果。木霉不仅在植物土传病害防治中具有重要作用，还能促进植物生长、提高植物免疫力、增强抗逆性。

关于木霉促进植株生长已有很多报道。杨春林等通过哈茨木霉T-h-30灌根处理后，黄瓜、番茄、芹菜幼苗株高、地茎及鲜质量均较对照显著增加：王禹佳等利用绿色木霉处理玉米后，相比对照总根长、根体积和根表面积分别提高74.0％、65.0％和47.4％。本研究中哈茨木霉经3种施用方式处理后的烟株株高、叶面积、总根长、根体积、地上部鲜质量和地下部鲜质量等均高于对照，与前人研究结果相似，其中灌根处理对以上指标促进效果最显著。其原因可能是灌根处理后土壤和烟株体内哈茨木霉定殖量更多，其代谢产物中具有幼苗生长的类植物生长素6-PP（6-n-pemyl-6H-pyran-2-one）以及可降解乙烯前体物质的ACC脱氨酶，缓解了乙烯对烟株生长的抑制作用。哈茨木霉通过诱导增加烟草侧根、丛生根、延伸根长度等方式，形成更发达的根系网络，其中总根长和分枝数的增加有利于烟株从更广泛的土壤中获取水和养分，根体积和根表面积的提高扩大了与土壤的接触面积和吸收范围：另一方面部分微溶或难溶的矿物质在哈茨木霉作用下溶解后被根系吸收，从而加快烟株生长。

各生理指标变化是衡量植株生长质量的重要依据，有研究表明棘孢木霉和哈茨木霉灌根均能显著提高黄瓜幼苗叶绿素含量、根系活力、叶片硝酸还原酶活性等生理指标。杨春平等发现在较高浓度木霉L24作用下，浸种处理相较叶面喷施更有利于提高玉米叶绿索含量和根系活力。本研究结果显示3种施用方式对烟株各生理指标促进效果整体表现为灌根>浸种>叶面喷施，经灌根处理后，烟株叶面积和叶绿素含量显著提高，加快了叶片光合速率，增加碳水化合物的形成和积累：同时烟株根系活力和硝酸还原酶活性升高，提高土壤水肥吸收和氮素利用效率，进而促进烟株生长和生物量的积累。

植物-木霉-病原菌互作是一个复杂的系统，诱导抗性在植物抗病过程中起着至关重要的作用，它是指在外界因子诱导下，植物启动自身防御系统，增强对病原菌的抗性现象，通常以防御性酶活性表示。已有研究表明木霉菌能通过诱导植物体内POD、CAT、PPO、PAL等防御性酶活性升高，抑制病原菌入侵。本试验结果显示，不同施用方式下，烟株体内哈茨木霉定殖量存在显著差异，以灌根处理各时期定殖量最高，同时哈茨木霉定殖量与烟草防御性酶活性和黑胫病防治效果呈正相关。说明在烟草疫霉胁迫下，哈茨木霉定殖量是影响烟草防御活性的关键因素。本试验以灌根处理后烟株根系POD、PPO、PAL和CAT活性提高最显著，分别较对照升高28.70%、71.34％、66.75%和105.92％，烟草黑胫病防治效果达到75.94%。与宋玉娟、庄敬华、陈捷等的研究结果一致。因此，诱导抗性可能是哈茨木霉防治烟草黑胫病的重要机制。

综上所述，在移栽时利用哈茨木霉灌根，能有效促进烟株生长，提高对烟草黑胫病的防治效果，在病原菌胁迫下，有利于诱导烟株产生抗性，抑制病原菌侵染，增强抗病能力。