不同月龄鲁西黑头羊瘤胃细菌多样性比较分析

谭秀文 孟宪锋 刘昭华 刘兴华 朱荣生 王可 崔绪奎 王建英 靳青

摘要：瘤胃是反刍动物重要的消化器官，瘤胃微生物的组成及其多样性直接关系到反刍动物对饲料的消化利用。本研究通过测定不同月龄鲁西黑头羊瘤胃液微生物菌群多样性及组成结构，探索瘤胃微生物发育规律，为鲁西黑头羊高技饲养提供理论依据。结果表明：（1）Shannon指数和Simpson指数各组之间无显著性差异．ACE指数和Cha01指数3月龄显著低于6月龄和12月龄；（2）拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（FirmicuLes）为优势菌门，普雷沃菌属（PrevoreDa）为瘤胃优势菌属，但各类群丰度在不同月龄间存在显著差异；（3）PCA分析显示，3月龄鲁西黑头羊瘤胃菌群个体间差异较小．6月龄与12月龄明显分离，表明菌群结构差异较大。综上，鲁西黑头羊瘤胃菌群在3月龄时相对稳定，随着月龄的增长，群落丰富度有所提高，表明3月龄时瘤胃功能仍在发育。

關键词：鲁西黑头羊；瘤胃；细菌；多样性

中图分类号：S826.9+21 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023）02-0155-04

瘤胃是反刍动物特有的消化器官，也是反刍动物消化和代谢的重要场所。瘤胃能够消化饲料中70%-85％的可消化物和50%的粗纤维，在此过程中，瘤胃微生物发挥着至关重要的作用。瘤胃微生物可将饲粮中的养分经发酵转化为可供反刍动物吸收利用的营养物质，为维持动物正常生理活动以及生产肉类和奶制品提供所需能量和营养，因此瘤胃微生物充当了主要的营养物质“转换器”。

反刍动物的瘤胃在断奶前类似于非反刍哺乳动物的单胃，断奶后逐渐发育具备反刍功能，成年后瘤胃占整个消化系统的60％-80％。幼龄反刍动物瘤胃微生物区系丰富度相对较低，随着时间的延长在数量和种类上发生明显变化，发育成熟后达到稳定状态，功能也逐渐完善，在反刍动物消化代谢和健康维持过程中发挥重要作用。

瘤胃及瘤胃微生物的发育受反刍动物品种、年龄、营养水平等多种因素的影响，充分了解瘤胃微生物区系的发育特点，是挖掘生产潜力的重要依据。鲁西黑头羊是以山东省地方品种小尾寒羊为母本、以南非黑头杜泊绵羊作父本杂交选育而成的优质肉羊新品种，关于其瘤胃微生物的结构及发育规律目前尚未展开研究。为此，本试验对不同生长阶段鲁西黑头羊公羊瘤胃微生物区系进行比较分析，以期为提高鲁西黑头羊生产性能提供科学依据。

1材料与方法

1.1样品采集

以山东省农业科学院畜牧兽医研究所培育的肉羊新品种鲁西黑头羊为研究对象，在鲁西黑头羊核心育种场随机选取3月龄、6月龄、12月龄3个年龄段的鲁西黑头羊各4只。晨饲6h后通过胃管式瘤胃液采样器（武汉科立博牧业科技有限公司）采集瘤胃液，分装于15 mL离心管，液氮速冻，带回实验室后转移至-80℃冰箱保存待测。

1.2瘤胃液细菌测定

瘤胃细菌16S rDNA测序委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成。首先，采用SDS方法对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和浓度，使用无菌水稀释样本至1 ng/uL。然后，以稀释的基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA V4区引物（515F和806R）进行PCR扩增，使用2％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，合格后进行等量混样并回收；最后，使用TruSeq@ DNA PCR-Free SamplePreparation Kit建库试剂盒进行文库构建，利用Illumina Miseq 2500高通量测序平台进行测序。

1.3数据处理与统计分析

测序完成后，使用FLASH（V 1.2.7）对样本的Reads进行拼接，使用fastp软件对拼接得到的Raw Tags进行过滤得到高质量的Clean Tags，Uchime algorithm去除其中的嵌合体序列后得到最终的有效数据（Effective Tags）。利用Uparse算法（Uparsev 7.0.1001）对全部Effective Tags进行聚类，以97％的一致性（idemity）将序列聚类成为OTUs。用Mothur方法与SILVA138的SSUrRNA数据库进行物种注释与分析，使用Qiime软件（Version 1.9.1）计算Chao 1、Shannon、Simpson、ACE、Goods-coverage指数，使用R软件（Version2.15.3）绘制PCA图。

数据采用Microsoft Excel 2007进行整理，使用SPSS 22.0软件进行差异显著性分析，并采用Duncan's法进行多重比较，P<0.05表示差异显著。

2结果与分析

2.1不同月龄鲁西黑头羊瘤胃细菌OTUs分析

为研究不同月龄鲁西黑头羊瘤胃细菌的物种组成，对所有样本的Effective Tags以97%的一致性进行OTUs聚类，共产生5 708个OTUs（图1），3月龄、6月龄、12月龄分别有3 559、3 824、3833个，三组共同拥有的OTUs为2 216个。这表明不同月龄鲁西黑头羊瘤胃菌群结构具有一定的特异性与相似性。平均序列长度为414 bp，所有样品测序覆盖率均在99.6％以上，表明测序深度能够准确反映瘤胃细菌的组成。

2.2不同月龄鲁西黑头羊瘤胃细菌alpha多样性

对不同月龄鲁西黑头羊瘤胃细菌多样性指数进行分析，结果（表1）显示，Shannon指数和Simpson指数在各月龄间无显著差异，表明各月龄间瘤胃细菌群落多样性相似：Chao 1指数和ACE指数在3月龄显著低于6月龄和12月龄，6月龄和12月龄间无显著差异，表明6月龄和12月龄的鲁西黑头羊细菌群落丰富度较3月龄时显著升高。

2.3不同月龄鲁西黑头羊瘤胃细菌种群结构

对所得有效序列在不同分类水平上进行物种注释和统计，鲁西黑头羊瘤胃液中共注释到细菌界和古生菌界微生物46门99纲272科342属。对总丰度前10的物种在门水平和属水平上进行分析，结果（图2）显示，在门水平上，拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）为鲁西黑头羊瘤胃中的优势菌门，平均相对丰度分别为54.09％和21.17％：其次为广古菌门（Euryarchaeota）和变形菌门（Proteobacteria），平均相对丰度分别为4.98%和3.64％，其他菌门相对丰度均低于3%。拟杆菌门的相对丰度随月龄的增长而升高，12月龄极显著高于3月龄和6月龄（P<0.01）：3月龄厚壁菌门相对丰度显著高于6月龄和12月龄（P<0.05）。

在属水平上，普雷沃菌属（Ptevotella）为瘤胃优势菌属，相对丰度为19.75%-25.80%，且12月龄显著高于3月龄（P<0.05）；其次为Rikenellace-ae_RC9_gut_group和Methanobrevibacter，平均相对丰度分别为9.83%和4.98%，各月龄间无显著差异；瘤胃球菌属（Runminococcus）在3月齡时平均相对丰度为3.2%，到12月龄时显著降至0.89％（P<0.05）。

2 4不同月龄鲁西黑头羊瘤胃细菌主成分分析

如图3所示，第一主成分和第二主成分的贡献率分别为17.65%和13.31％。3月龄各样本聚集在一起，表明个体间差异较小：6月龄组与12月龄组较为分散，表明个体间有一定的差异。与3月龄组相比，6月龄组群落结构差异不明显，但表现出分离的趋势，12月龄组与3月龄组能很好地分离，表明3月龄组和12月龄组间群落结构差异显著。

3讨论与结论

瘤胃是反刍动物区别于其他哺乳动物的消化器官，刚出生时瘤胃微生物的组成相对单一，随着对母乳及饲粮的采食，瘤胃不断发育，瘤胃微生物逐渐定殖并繁殖，最终形成稳定微生物区系，以维持反刍动物正常的生长发育需求。幼龄阶段的瘤胃微生物区系组成与成熟动物差异明显，一般情况下，将4周岁以后反刍动物的瘤胃微生物区系定义为成熟的瘤胃微生物区系。另有研究认为，在2周岁以前反刍动物瘤胃微生物都有可能发生较大变化。本研究中，鲁西黑头羊在3月龄时的瘤胃微生物丰富度显著低于6月龄和12月龄，且个体间差异较小。这说明此时瘤胃菌群相对比较均一，仍处于快速发展时期，若此时通过优化饲粮组成以及合理使用添加剂等调控手段对瘤胃微生物进行干预以加强瘤胃的消化代谢功能，仍可取得一定的效果。随着月龄的增加和瘤胃的发育，6月龄之后至成年，瘤胃菌群逐渐趋于成熟达到各自的“稳态”，再对其进行调整，难度增大。

马健等统计表明，反刍动物瘤胃微生物区系在门水平上以变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）细菌为优势菌，在属水平上以普雷沃菌属（Prevotella）细菌为优势菌，但其在不同年龄段所占比例不同，其中变形菌门的丰度随动物年龄的增长显著降低。本研究中，拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）在鲁西黑头羊瘤胃菌群中占绝对优势，且拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度随月龄显著增长，变形菌门（Proteobacteria）丰度随月龄的增长显著降低，与以上研究结果一致，说明试验羊瘤胃发育正常，微生物区系处于动态平衡，体况较佳；在属水平上，普雷沃菌属（Prevotella）相对丰度在20%左右，且12月龄时较3月龄显著提高，说明瘤胃降解蛋白、淀粉等营养物质的消化代谢能力有所增强。

综上，鲁西黑头羊在3月龄之前，瘤胃仍处于快速发育阶段，微生物区系具有较高的可塑性。在饲养管理过程中，可在3月龄前对其进行有效调控，为后期生产性能的提高奠定基础。