一种新合成吡啶类化合物对黑质多巴胺能神经元电活动的调制作用

王紫君　李昂　石丽敏

［摘要］目的研究一种新合成的吡啶类化合物对黑质多巴胺能神经元电活动的调制作用。方法应用全细胞膜片钳技术观察该化合物对黑质多巴胺能神经元自发放电频率、诱发放电、内向整流（Sag）幅度等电活动相关指标的影响。结果C57/BL6小鼠黑质脑片灌流500 μmol/L化合物，多巴胺能神经元自发放电频率明显受到抑制（t=5.396，P＜0.05），0～40 pA的除极电流刺激后记录的神经元诱发放电次数明显减少；给予神经元40 pA的除极电流刺激，与基础放电活动相比，峰电位间隔时间、动作电位的起始时间和时程均明显增加（t=1.920～2.558，P＜0.05）；与基础Sag幅度相比，-200 pA电流刺激后的Sag幅度明显减小，差异具有统计学意义（t=3.149，P＜0.05）。结论此化合物能够抑制正常C57/BL6小鼠黑质多巴胺能神经元的興奋性并降低Sag幅度，对神经元的电活动发挥调控作用。

［关键词］帕金森病；电生理学；吡啶类；多巴胺能神经元；动作电位

［中图分类号］R338.2［文献标志码］A［文章编号］2096-5532（2023）03-0341-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.085［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］https：//kns.cnki.net/kcms2/detail/37.1517.R.20230731.1057.002.html;2023-07-3116：03：18

REGULATORY EFFECTS OF A NOVEL SYNTHESIZED PYRIDINE COMPOUND ON ELECTRICAL ACTIVITY OF DOPAMINERGIC NEURONS IN THE SUBSTANTIA NIGRA  WANG Zijun， LI Ang， SHI Limin （Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the modulatory effects of a novel synthesized pyridine compound on the electrical activity of dopaminergic neurons in the substantia nigra. MethodsThe whole-cell patch clamp technique was used to record the changes induced by the compound in the electrical activity of substantia nigra dopaminergic neurons （spontaneous discharge frequency， evoked firing rate， and sag amplitude）. ResultsWith C57/BL6 mouse substantia nigra slices under perfusion with the compound at a concentration of 500 μmol/L， dopaminergic neurons spontaneous firing rate was significantly decreased （t=5.396，P<0.05）. The evoked firing rate was significantly reduced in response to depolarizing current pulses of 0-40 pA; in response to a depolarizing current pulse of 40 pA， the dopaminergic neurons interspike interval and action potential duration and initial time were significantly increased as compared with the baseline electrical activity （t=1.920-2.558，P<0.05）. In response to a current pulse of -200 pA， the dopaminergic neurons exhibited a significantly lowered sag amplitude compared with the baseline sag amplitude （t=3.149，P<0.05）. ConclusionThe novel synthesized compound could inhibit the excitability and decrease the sag amplitude of substantia nigra dopaminergic neurons in normal C57/BL6 mice， with a regulatory effect on the electrical activity of neurons.

［KEY WORDS］Parkinson disease; electrophysiology; pyridines; dopaminergic neurons; action potentials

帕金森病（PD）是以中脑黑质致密带多巴胺（DA）能神经元变性、缺失为主要特征的慢性神经系统疾病，出现α-突触核蛋白（α-syn）积聚沉淀以及纹状体DA分泌减少等病理变化[1]。中国人口老龄化现象的日益加重导致PD的发病率逐年升高，严重影响了人们的生活质量。目前PD主要以左旋多巴类药物干预治疗为主，但长期服用该药物会出现疗效不稳定、发生胃肠道反应等副作用[2]。因此，寻求一种有效且副作用少的新型防治药物成为PD治疗领域的热点研究问题。本实验室前期工作观察到，4-氨基吡啶（4-AP）对神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）以及1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的PD模型障碍具有一定的改善作用[3-4]；WEI等合成的5种吡啶类衍生物，也具有良好的生物效应[5-6]。基于以上研究结果，本研究团队与成都中医药大学开展合作，对新合成的19种吡啶类化合物进行生物学研究，初步证实12号化合物能诱导细胞自噬、减轻α-syn聚集，提示它在PD中具有潜在的保护作用。已知黑质DA能神经元具有自发放电活动，其生理功能的维持与神经元电活动密切相关，因此本实验应用脑片膜片钳技术，从电生理的角度探讨12号化合物对DA能神经元电活动的调制作用，从而为PD的临床治疗提供潜在靶点。现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1动物及主要试剂

出生15～20 d的C57/BL6小鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物的饲养及手术符合青岛大学动物伦理学要求。实验所用化合物由成都中医药大学合成提供，用二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为200 mmol/L的储存液，-20 ℃保存，工作液浓度500 μmol/L。

1.2溶液配制

人工脑脊液（ACSF）的配制：124.0 mmol/L NaCl、3.0 mmol/L的KCl、2.4 mmol/L的CaCl2、1.3 mmol/L的MgCl2、1.3 mmol/L的NaH2PO4、26.0 mmol/L NaHCO3、10.0 mmol/L Glucose混合，调整pH值为7.4（1 mol/L NaOH稀释）、渗透压为310 mOsm。低钙切片液的配制：124.0 mmol/L NaCl、3.0 mmol/L KCl、0.5 mmol/L的CaCl2、1.0 mmol/L的MgCl2、1.3 mmol/L的NaH2PO4、26.0 mmol/L NaHCO3、10.0 mmol/L Glucose混合，用1 mol/L NaOH 调节pH值至7.4，用渗透压测量仪调节渗透压至310 mOsm，并持续通体积分数0.05 CO2及体积分数0.95 O2的混合气进行氧合（切片液需提前放入冰箱-80 ℃冷冻40 min成冰沙状）。电极内液的配制：120.0 mmol/L K-gluconate、10.0 mmol/L的HEPES、10.0 mmol/L的EGTA、2.0 mmol/L的MgCl2、2.0 mmol/L的Na2ATP、0.3 mmol/L Na2GTP、20.0 mmol/L KCl混合，用1 mmol/L KOH调节pH值至7.3，将渗透压调节至290 mOsm，-20 ℃保存分装备用。

1.3离体黑质脑片制备

小鼠迅速断头取脑，置于4 ℃ ACSF中，1 min后将修剪好的脑切成250 μm厚的脑切片，放入连续通入体积分数0.95 O2及体积分数0.05 CO2混合气体的ACSF中，孵育1 h，然后将脑片室温下放置。随机取其中1片进行脑片全细胞膜片钳实验，其余脑片放在ACSF中，用于后续实验。

1.4脑片全细胞膜片钳电生理学记录

将离体脑片转移至持续灌流ACSF（持续通入体积分数0.95 O2及体积分数0.05 CO2的混合气体）的浴槽内，选择健康、饱满、边界清晰的细胞进行全细胞膜片钳记录。将抛光的玻璃微电极注入合适体积的电极内液，直至电极尖端进入液面以下，使电极尖端慢慢接近细胞表面直至在细胞表面压出类似“酒窝”的形状，此时电流变小，电阻慢慢变大。迅速释放正压，快速达到千兆封接。如果电阻没有达到千兆，则通过注射器给予细胞膜片一个负压，使之达到千兆封接，并补偿快电容。之后，采用负压法吸破电极与细胞相接触的膜片，使电极与细胞内液相通，并补偿慢电容。转换至电流钳模式，将电流钳置于0 pA，完成全细胞电流钳模式记录，判断为黑质DA能神经元后，转换至全细胞电压钳模式，将电压钳置于-70 mV，完成全细胞电压钳模式电流记录。数据用Patch master软件采集并储存，用Minianaly-sis、Clamfit等软件分析。

1.5统计学分析

应用SPSS 20.0和GraPhPad Prism 5 统计软件进行处理，实验结果以±s形式表示，配对样本间比较采用配对t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1化合物对黑质DA能神经元自发放电频率的影响

参考本实验室之前的研究报道[7]，主要根据位置、形态、放电特征等指标鉴定DA能神经元：位于中脑腹侧边缘；细胞一般呈纺锤、三角或多极形，胞体较大，直径大于25 μm；在电流钳模式下，给予神经元-100 pA的超极化电流刺激后，神经元膜电位出现显著的内向整流（Sag）特征；在全细胞模式下，神经元表现出频率1～5 Hz的自发放电活动。

本实验共记录到了7个DA能神经元，其基础自发放电频率为（1.46±0.53）Hz，当灌流500 μmol/L的化合物10 min后，其放电频率降低为（0.33±0.10）Hz，差异有显著性（t=5.396，P＜0.05），延长至15 min后细胞的自发放电活动被完全抑制。

2.2化合物对黑质DA能神经元诱发放电活动的影响

在电流钳模式下，给予DA能神经元0～40 pA的除极电流刺激后记录诱发放电活动的相关指标。在记录到的7个神经元中，随着除极电流幅度的增加，动作电位爆发次数增多，以40 pA的除极电流刺激为例分析数据，在未灌流化合物前40 pA除极电流诱发的动作电位个数是3，当灌流500 μmol/L化合物后诱发动作电位个数为1，灌流后除极电流诱发的动作电位个数明显减少。分析动作电位其他指标的变化情况结果显示，灌流化合物后，峰电位间隔时间从（0.083 4±0.020 1）s增加至（0.110 6±0.017 2）s，动作电位时程从（0.998 0±0.415 7）s增加至（1.427 6±0.763 7）s，动作电位起始时间从（0.984 4±0.784 0）s增加至（2.911 8±0.255 1）s，差异均具有统计学意义（t=1.920～2.558，P＜0.05）。

2.3化合物对黑质DA能神经元Sag的影响

在电流钳记录模式下，给予一系列的超极化电流刺激（-200～0 pA，2 s）后，DA能神经元表现出显著的Sag特征，即电位出现先快速超极化后除极，这种电位反转的变化形成了典型的Sag。在灌流500 μmol/L化合物后再次给予相同的超极化电流刺激，每个电流刺激下的Sag幅度均明顯减小。以-200 pA 的超极化电流刺激为例，Sag幅度由灌流前的（47.29±11.33）mV 减少至灌流后的（30.27±13.31）mV，其差异具有统计学意义（t=3.149，P＜0.05）。

3討论

以往我们观察到，4-AP对MPP+引起的DA能MES23.5细胞和原代培养的中脑腹侧神经元的损伤有明显的保护作用[3]，能够有效改善MPTP诱导的PD小鼠的运动行为，如运动速度和运动平衡能力[4]。由WEI等合成的吡啶类衍生物被证实能够在PD的体外模型中减少α-syn积累，减轻氧化应激损伤和炎症，诱导Rho激酶激活[5-6]。此外有研究表明，4-AP类化合物还可以防止中枢神经系统的神经轴索损失，包括促进髓鞘再生、改善神经导电性和加速功能恢复等[8-9]；利用4-AP合成的热凝胶聚合物能够促进创伤性周围神经损伤后的功能恢复[10]。以上研究均提示吡啶类化合物对于神经系统疾病具有一定的保护作用。本实验主要观察了新合成的化合物是否影响黑质DA能神经元的电活动，结果表明该化合物能显著降低DA能神经元的自发及诱发放电频率，并降低Sag幅度。

黑质DA能神经元在正常生理状态下的电活动是维持其基本功能的关键，电活动紊乱是其发病机制的重要影响因素。黑质DA能神经元在全细胞电流钳模式下主要表现为规则的紧张性放电，即起搏放电，少数细胞无自发放电[7]。对于紧张性放电的神经元，其动作电位频率较低，本实验记录到的DA能神经元基础放电频率为1～2 Hz。DA能神经元的异常放电活动与PD的发病相关。α-syn沉积是PD病人的主要病理改变，在PD中黑质DA能神经元的缺损导致丘脑底核被过度激活，神经递质谷氨酸过量累积[11]。此外，环境毒素也能够增加谷氨酸的产生。过量的谷氨酸结合其受体（NMDA或者AMPA）并打开电压门控钙通道，引起Ca2+由细胞外大量内流，提高了DA能神经元内的Ca2+浓度，导致氧化应激和Ca2+兴奋性毒性[12-13]。而兴奋性毒性可能是DA能神经元的死亡机制之一[14-17]。本实验观察到，新合成的化合物能抑制神经元放电，提示该化合物在对抗兴奋性毒性、平衡神经元电活动中起到调制作用。

该化合物通过何种机制影响神经元的电活动尚不清楚。本实验观察到，应用化合物处理细胞后，Sag的幅度明显降低。Sag是黑质DA能神经元受到超极化电流刺激时，膜电位出现的先快速超极化再除极的电位反转，一直被认为是DA能神经元的重要识别标志[18]，该特性由超极化激活的环核苷酸门控通道（HCN通道）介导[19-21]。HCN通道在调节神经元的兴奋性、节律性以及突触传递等活动中发挥着重要作用，应用HCN通道阻断剂可以显著减少神经元放电[22-27]。结合本文实验结果，我们推测该化合物的作用靶点可能与HCN通道有关，通过抑制HCN通道，可降低神经元Sag幅度，减少自发及诱发放电活动。

综上所述，本研究证实新合成化合物对黑质DA能神经元电活动有调制作用，这为论证该化合物在PD中的应用提供了新的实验依据。

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（本文編辑马伟平）