不同月龄A53T小鼠背根神经节中α-Syn表达变化

韩帆　焦倩　杜希恂　阎春玲　姜宏　陈曦

［摘要］目的探讨不同月龄A53T转基因（A53T）小鼠脊髓背根神经节（DRG）中α-突触核蛋白（α-Syn）表达水平的变化。方法6月龄和12月龄野生型（WT）小鼠和A53T小鼠经乌拉坦腹腔麻醉后处死，在体视显微镜下取出胸段、腰段和荐段的DRG组织，采用蛋白免疫印迹法检测DRG中α-Syn的表达水平。结果与相同月龄WT小鼠相比，6月龄及12月龄A53T小鼠DRG中α-Syn表达量显著增加（F=59.164、55.681，P<0.01）；与6月龄A53T小鼠相比，12月龄A53T小鼠DRG中α-Syn的表达量显著增加（F=13.802，P<0.05）。结论A53T小鼠DRG中α-Syn表达量高于同月龄WT小鼠，且其表达量随年龄增长而增加。

［关键词］α突触核蛋白；帕金森病；小鼠，转基因；神经节，脊

［中图分类号］R338.2［文献标志码］A［文章编号］2096-5532（2023）03-0337-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.075［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］https：//kns.cnki.net/kcms2/detail/37.1517.R.20230719.1618.003.html;2023-07-2014：53：22

EXPRESSION OF α-SYNUCLEIN IN THE DORSAL ROOT GANGLION OF A53T MICE WITH DIFFERENT AGES IN MONTHS  HAN Fan， JIAO Qian， DU Xixun， YAN Chunling， JIANG Hong， CHEN Xi  （State Key Discipline： Physiology （in Incubation）， Department of Physiology， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression level of α-synuclein （α-Syn） in the dorsal root ganglion （DRG） of A53T transgenic mice with different ages in months. MethodsWild-type （WT） mice and A53T mice， aged 6 or 12 months， were sacrificed after intraperitoneal anesthesia with urethane. DRG tissue samples of the thoracic， lumbar， and sacral segments were collected under a stereomicroscope， and Western blotting was used to measure the expression level of α-Syn. ResultsCompared with the WT mice with the same age in months， the A53T mice aged 6 or 12 months had a significant increase in the expression level of α-Syn in DRG （F=59.164，55.681;P<0.01）. Compared with the A53T mice aged 6 months， the A53T mice aged 12 months had a significant increase in the expression level of α-Syn in DRG （F=13.802，P<0.05）. ConclusionA53T mice have a higher expression level of α-Syn in DRG than WT mice with the same age in months， and the expression level of α-Syn increases with age.

［KEY WORDS］alpha-synuclein; Parkinson disease; mice， transgenic; ganglia， spinal

帕金森病（PD）是一種主要影响运动功能的神经退行性疾病，其发病率随着年龄增加而逐渐上升[1-3]。目前，PD发生的确切原因和机制仍不完全清楚，但大量研究表明，基因突变是重要的因素之一[4-7]。A53T转基因（A53T）小鼠是一种常见的PD模型小鼠，其体内携带的人类A53T突变型α-突触核蛋白（α-Syn）基因可改变α-Syn的结构，使原本可溶性的α-Syn单体转变为不溶性的多聚体，可在动物体内重现由α-Syn聚集起始的PD病理过程[8-12]。根据BRAAK学说可知，胃肠道可能是α-Syn发生病变的起始部位[13-16]，且这些病理性α-Syn会通过外周神经系统逐渐向中枢传播[17]。已有大量实验证实迷走神经在α-Syn的肠-脑传播中承担主要作用，但是消化道与中枢之间还存在其他神经联络，如交感神经，其传入纤维的胞体主要汇聚在脊髓背根神经节（DRG）中。为明确DRG中是否也存在着α-Syn高表达，本实验观察了不同月龄A53T小鼠DRG中α-Syn的含量变化，从而为交感神经传入纤维参与α-Syn从胃肠道传播至中枢的可能作用提供证据。现将结果报告如下。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物A53T小鼠（品系名称：B6；C3-Tg（Prnp-SNCA*A53T）83Vle/J），SPF级，购于南京大学模式动物研究所。小鼠饲养于清洁级动物房中，可自由进食饮水，饲养环境为光照模拟自然昼夜节律，12 h明暗交替，温度保持在20～24 ℃，相对湿度保持在40%～60%。选用6月龄和12月龄的纯合子A53T小鼠作为实验组，同窝相同月龄的野生型（WT）小鼠作为对照组。

1.1.2试剂α-Syn抗体、β-tubulin抗体购于美国Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔和山羊抗鼠抗体购于英国Thermo Fisher Scientific公司；0.45 μm PVDF转印膜、ECL化学发光液均购于美国Millipore公司：RIPA裂解液购于中国Com Win Biotech公司。A53T小鼠基因型鉴定PCR试剂盒购于中国Vazyme生物科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1A53T小鼠基因鉴定A53T纯合子小鼠由A53T杂合子小鼠配种育得，饲养至1月龄进行分笼和鉴定。于尾尖部截取0.5 cm长鼠尾组织提取DNA，按照试剂盒（Taq Pro HS U+Probe Master Mix，Vazyme生物科技有限公司）说明配制实时荧光定量PCR反应体系并进行实验。根据PCR数据计算△Ct值，通过比较实验组与对照组纯合子目的基因的△Ct值，确定基因型。

1.2.2蛋白免疫印跡法检测DRG中α-Syn表达小鼠经乌拉坦腹腔麻醉处死后取出脊柱，于体视显微镜下取出胸段、腰段和荐段的DRG组织放入EP管中，先用剪刀将组织剪碎，再加入配制好的RIPA裂解液，充分磨碎组织。冰上静置裂解30 min后，应用高速离心机在4 ℃下以12 000 r/min离心20 min，吸取上清液转移至新的1.5 mL EP管中，利用BCA试剂盒和酶标仪进行蛋白质定量，计算上样量。按比例加入loading buffer，充分混匀，100 ℃煮沸10 min使蛋白充分变性，-20 ℃冻存。蛋白样品经SDS-PAGE电泳（90 V、30 min，120 V、60 min）分离后，湿法转至孔径为0.45 μm的PVDF膜上，按蛋白Marker将目标蛋白裁剪出来，经脱脂奶粉封闭、一抗孵育、HRP-IgG二抗孵育后，用TBST缓冲液洗净，将膜与ECL超敏发光液反应后置于凝胶成像系统内进行观察并拍摄图像。采用Image J分析软件对蛋白条带进行灰度计算，目的蛋白表达水平以α-Syn和β-tubuling条带灰度值的比值表示。

1.3统计学处理

应用SPSS 25.0软件进行统计学处理。小鼠DRG中α-Syn的表达量以±s表示，不同月龄WT和A53T小鼠DRG中α-Syn表达水平比较采用析因设计的方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1A53T小鼠鉴定

PCR结果显示，对照组和实验组纯合子目的基因△Ct平均值分别为5.84±0.57和6.11±0.47。△Ct值大于对照组纯合子目的基因△Ct值的小鼠为A53T纯合子小鼠。共选取10只A53T纯合子小鼠进行实验。

2.2不同月龄WT和A53T小鼠DRG中α-Syn表达比较

蛋白免疫印迹法检测结果显示，6月龄WT组（n=6）、6月龄A53T组（n=6）、12月龄WT组（n=4）和12月龄A53T组（n=4）小鼠DRG中α-Syn表达水平分别为0.18±0.07、1.09±0.21、0.46±0.22和1.63±0.35。析因设计方差分析结果显示：F_月龄=17.417，P<0.01；Ｆ_组别=112.168，P<0.01；F_月龄×组别=1.727，P＞0.05。与同月龄WT组小鼠相比，6月龄、12月龄A53T组小鼠DRG中α-Syn表达量显著增高，分别增加了505.56%和254.35%，差异均具有统计学意义（F=59.164、55.681，P<0.01）；12月龄A53T组小鼠DRG中α-Syn表达量比6月龄A53T组小鼠增加了50.46%，两组相比差异具有统计学意义（F=13.802，P<0.05）。表明A53T小鼠DRG中α-Syn的表达远高于同月龄WT小鼠，且随年龄的增长，其表达量增加。

3讨论

大量临床数据表明，在典型的PD运动症状出现之前，胃肠道功能障碍就已经在PD病人身上长期存在，包括便秘、胃轻瘫等[18-24]。德国的BRAAK教授于2003年提出了经典的PD分期学说，该学说指出胃肠道是病理性α-Syn蛋白传播的起源地，并且通过肠脑轴逐渐蔓延至中枢神经系统[25-26]。其中，α-Syn通过迷走神经传播进入迷走神经运动背核（DMV）是肠脑轴传播的重要组成部分。后续有实验表明，迷走神经切断术可以使PD的发展进程大幅减缓，并且使PD的患病风险大大降低[27-30]。但该法仍不能完全杜绝PD，这提示α-Syn在胃肠与中枢之间传播可能还有其他的通道。支配消化道的神经除迷走神经外，还有交感神经，其传入纤维的胞体主要汇聚在脊髓DRG中，可感受消化道内机械刺激（如管壁扩张、胃肠道蠕动等）、化学刺激（如管腔内毒性物质、酸碱度等）以及温度的变化等，并将这些信息传入中枢神经系统。与迷走神经类似，交感神经在消化道和中枢神经系统之间也起桥梁作用，那么它是否在α-Syn的传播过程中起某些作用呢？本研究对此进行了探讨。

本实验选取小鼠胸椎、腰椎和荐椎处的DRG组织进行检测，来自消化道的交感神经传入纤维主要通过以上部位进入脊髓，可充分反映交感神经传入纤维在病理性α-Syn肠脑传播中的作用。实验结果显示，与同月龄WT组小鼠相比，6月龄、12月龄A53T组小鼠DRG中α-Syn表达量显著增加，且随年龄的增长，A53T小鼠DRG中α-Syn表达量会进一步增加，表明交感神经中确实存在病理性α-Syn。值得注意的是，本实验所取组织来源于A53T小鼠，该小鼠是一种携带人类A53T突变型α-Syn基因的PD模型小鼠，其体内存在广泛的人A53T突变型α-Syn过表达。那么，本实验中小鼠DRG中α-Syn增多的原因，是否仅与该部位的基因突变相关呢？已有实验表明，3月龄A53T小鼠小肠组织中α-Syn的表达已经明显升高，且出现了消化道功能障碍，但此时中枢神经系统内并未出现病理性的α-Syn，此种情况甚至会持续到6月龄以后，提示老龄A53T小鼠中枢病理性α-Syn的增多可能亦与该蛋白从外周至中枢的传播有关[31-33]。故作者推测A53T小鼠DRG中α-Syn的增多也可能与交感神经在此传播过程中的作用相关。有其他研究也报道了交感神经的可能作用，如PD病人肾上腺中存在α-Syn的沉积，肾上腺髓质中包含由交感神经胞体组成的神经节，在这些神经节及发出的神经纤维中均观察到α-Syn聚集的现象[34-35]；在膀胱和生殖器官附近的交感神经神经节中同样出现了路易小体[24，36]。这些证据均表明交感神经可能参与了PD进展，并且可能与病理性α-Syn的传播有关。

綜上所述，A53T小鼠DRG中α-Syn的表达量显著增加，且其表达量随年龄的增长同步上升，提示交感神经在PD进展中可能发挥作用。本实验结果可为PD发生机制研究提供实验依据，同时为通过阻断α-Syn由外周向中枢传播来治疗PD提供了新的思路。

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（本文編辑马伟平）