免疫沉淀分离外泌体对PC12细胞上清中α-syn含量的影响

杨桐桐　王晓婷　谢俊霞　宋宁

［摘要］目的探讨采用免疫沉淀方法分离PC12多巴胺能细胞上清中外泌体对细胞上清中α-突触核蛋白（α-syn）含量的影响。方法利用多西环素诱导PC12细胞高表达α-syn，培养24 h后收集细胞上清液，采用免疫沉淀方法进行外泌体的分离纯化，采用酶联免疫吸附测定方法测定外泌体分离前后细胞上清中α-syn的含量。结果采用免疫沉淀方法可以分离出细胞上清中的外泌体，分离出的外泌体表达特异性标记物alix和CD63。外泌体分离后，上清中α-syn的含量从（2 999.0±193.0）ng/L下降为（2 276.0±81.8）ng/L，降低了（723.0±111.2）ng/L（t=4.580，P<0.05）。结论免疫沉淀分离外泌体能够降低PC12细胞上清中α-syn的水平。

［关键词］α突触核蛋白；外泌体；免疫沉淀法；PC12细胞

［中图分类号］R338.2［文献标志码］A［文章编号］2096-5532（2023）03-0329-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.087［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］https：//kns.cnki.net/kcms2/detail/37.1517.R.20230731.1057.003.html;2023-07-3115：48：26

EFFECT OF EXOSOME ISOLATION BY IMMUNOPRECIPITATION ON Α-SYNUCLEIN LEVEL IN THE SUPERNATANT OF PC12 CELLS  YANG Tongtong， WANG Xiaoting， XIE Junxia， SONG Ning （Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of isolation of exosomes from the supernatant of PC12 dopaminergic cells by immunoprecipitation on the α-synuclein （α-syn） level in cell supernatant. MethodsDoxycycline was used to induce α-syn over-expression in PC12 cells. After 24 h of culture， the supernatant was collected， and the exosomes were isolated and purified by immunoprecipitation. The level of α-syn in the supernatant before and after exosome isolation was determined by enzyme-linked immunosorbent assay. ResultsExosomes in cell supernatant could be isolated by immunoprecipitation， and specific markers alix and CD63 were expressed in the isolated exosomes. After exosome isolation， the level of α-syn in the supernatant decreased from （2 999.0±193.0） ng/L to （2 276.0±81.8） ng/L by （723.0±111.2） ng/L （t=4.580，P<0.05）. ConclusionExosome isolation by immunoprecipitation can reduce the level of α-syn in the supernatant of PC12 cells.

［KEY WORDS］alpha-synuclein; exosomes; immunoprecipitation; PC12 cells

帕金森病（PD）是一種常见的神经退行性疾病，遗传、环境以及年龄因素均可能参与PD发病[1-2]。PD的主要病理学表现为黑质中多巴胺能神经元的丢失以及黑质残存多巴胺能神经元中形成路易小体和路易神经突，路易小体的主要成分是聚集形式的α-突触核蛋白（α-syn）。近年来研究发现，α-syn具有阮病毒样特征，可以在细胞间传播[3]。外泌体是一种直径30～150 nm的囊泡，可以携带包括α-syn在内的细胞内成分在细胞间进行传递[4]。由于外泌体特殊的脂膜结构，其内含有的致病蛋白更不容易被细胞间隙的蛋白酶水解且容易被细胞摄取，因此值得进一步研究[5]。然而，对于在细胞间传播的外泌体形式的α-syn所占比例仍存在较大争议。有研究表明，利用免疫沉淀方法可以从细胞上清中分离外泌体[6-7]。本实验旨在探讨采用免疫沉淀方法分离PC12多巴胺能细胞上清中外泌体对细胞上清中α-syn含量的影响。

1材料和方法

1.1实验材料

可诱导高表达α-syn PC12细胞由DAVID C. RUBINSZTEIN教授馈赠；DMEM高糖培养液购自Hyclone公司；胎牛血清和马血清购自依科赛公司；多西环素购自Sigma公司；CD63抗体购自Novus公司；蛋白A/G琼脂糖珠购自Santa Cruz公司；flotillin-1抗体购自Abcam公司；alix抗体购自Cell Signaling Technology公司；酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购于Biolegend公司；ECL发光液购于雅酶公司。

1.2高表达α-syn PC12细胞的培养和细胞上清液的收集

将状态良好的PC12细胞计数后接种于6孔板中，待其密度达到60%左右时，加入2 mg/L 多西环素作用24 h诱导细胞高表达α-syn。更换为无血清培养液，再次培养24 h细胞密度达到90%～95%，收集上清液。上清液在4 ℃下以3 500 r/min离心15 min，去除细胞碎片和死细胞。

1.3免疫沉淀分离细胞上清中的外泌体

将牛血清清蛋白（BSA）溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成2 g/L缓冲液。取500 μL PBS/BSA缓冲液稀释50 μL蛋白A/G琼脂糖珠并在4 ℃下孵育过夜。以PBS洗涤珠子3次后重悬于100 μL抗flotillin-1抗体（用2 g/L PBS/BSA缓冲液以1∶100比例稀释）中，4 ℃孵育4 h。以PBS洗涤珠子3次后收集蛋白A/G琼脂糖珠，加入离心后的细胞上清液200 μL，4 ℃孵育3 h。在4 ℃下以1 000 r/min离心1 min，去除蛋白A/G琼脂糖珠后收集上清液。

1.4ELISA检测

采用ELISA法测定外泌体分离前后细胞上清中α-syn的含量，严格按照试剂盒要求进行操作。

1.5蛋白质免疫印迹检测

用10 g/L SDS细胞裂解液洗脱上述的琼脂糖珠，用于免疫印迹检测。蛋白质用80 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上。膜在4 ℃下孵育过夜，使用外泌体特异标记蛋白一抗alix（1∶1 000）和CD63（1∶1 000）检验免疫沉淀的效果，加辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗（1∶10 000）孵育，用ECL发光液显影。使用Image J软件进行条带灰度值分析。

1.6统计学处理

应用Prism 5软件进行统计学分析，所得计量资料数据以±s表示，采用配对t检验进行两组均数的比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1免疫沉淀分离外泌体的鉴定

用flotillin-1抗体下拉细胞上清液中的外泌体，使用外泌体标记蛋白alix和CD63进行免疫印迹检测。结果显示，未经免疫沉淀处理的细胞上清液无蛋白质印迹，琼脂糖珠洗脱液有明显的蛋白质富集，表明采用免疫沉淀方法可以从细胞上清中分离外泌体。见图1。

2.2分离外泌体对PC12细胞上清中α-syn含量的影响

ELISA检测结果显示，外泌体分离前后的细胞上清液中α-syn的浓度分别为（2 999.0±193.0）、（2 276.0±81.8）ng/L，外泌体分离后较分离前降低了（723.0±111.2）ng/L，差异具有统计学意义（t=4.580，P<0.05）。

3讨论

α-syn主要存在于中枢神经系统（CNS），尤其在皮质、海马、纹状体、丘脑和小脑等脑区高度表达。据报道，α-syn能调节突触膜的各种生理过程和性质，例如囊泡的大小，突触囊泡的运输、对接和回收以及神经遞质释放等[8-9]。生理条件下，α-syn呈舒展的可溶性结构，但基因突变、α-syn翻译后修饰、α-syn浓度升高以及环境因素都可能引起α-syn聚集形成寡聚体或者不溶性的纤维结构[1]。α-syn的聚集是PD最明显的神经病理学特征，目前研究认为，α-syn的病理改变在PD的发病机制中起着核心作用[10-12]。越来越多来自PD病人、动物模型以及培养细胞的证据表明，α-syn可以在细胞之间传播，而且细胞外α-syn在PD发生发展的过程中起着重要作用[13-14]。

外泌体是由多种细胞分泌的小囊泡，可以携带包括α-syn在内的多种细胞内成分在细胞之间进行传递[4，15]。早期内体膜向内出芽形成的管腔内泡（ILVs）逐渐成熟为多泡体（MVBs），MVBs与质膜融合，被释放到细胞外的ILVs即为外泌体[16-18]。外泌体从各种细胞分泌并释放到细胞外空间，参与了细胞间的物质传递，许多致病蛋白已被证实与外泌体有关，例如阿尔茨海默病中的β淀粉样蛋白（Aβ）[19-20]和tau[21]、PD中的α-syn[22-23]。此外，狭小的空间可以使大分子处于高浓度状态，从而产生“大分子拥挤现象”，可以促进致病蛋白的聚集，因此通过外泌体形式进行传播的致病蛋白致病效率更高、更值得关注[24]。

外泌体α-syn是细胞外α-syn在细胞间传播的重要形式。有研究显示，使用来自PD病人脑脊液的外泌体处理H4细胞，在受体细胞内诱导了α-syn的进一步聚集，表明了脑脊液外泌体α-syn在疾病进展中的可能作用[22]。该研究还表明，脑脊液中外泌体形式的α-syn含量只占到2.17%，大部分的α-syn都是以游离形式存在。另外一项研究表明，与健康对照相比，PD病人脑脊液外泌体中总α-syn和聚集形式的α-syn含量均显著降低，这通常被认为是α-syn在脑内过度沉积的证明[25]。然而，血浆中CNS来源的外泌体形式的α-syn含量增加[26]。这可能是由于PD病人CNS中过量有害的α-syn外排清除导致的。α-syn一般在溶酶体降解，据报道PD病人的溶酶体功能降低[27]。这些需要溶酶体降解的蛋白进入MVBs，MVBs与质膜融合，将外泌体释放到胞外，这可能是病理条件下，神经元清除α-syn的机制[28]。最近有研究报道，血浆外泌体α-syn还可用于PD、多系统萎缩（MSA）等神经变性疾病的诊断，例如PD病人血浆中神经细胞来源的外泌体α-syn显著升高[26]，MSA病人血浆中少突胶质细胞来源的外泌体α-syn显著降低[29]。由于血浆来源的外泌体更易获得，因此血浆外泌体中α-syn或其他致病蛋白的水平变化，可能是神经相关疾病诊断的新靶点[30-32]。

有研究认为，外泌体α-syn只占分泌至细胞外α-syn的一小部分，对疾病的传播没有显著影响[24]。但如上所述，少量脑脊液中的外泌体α-syn足以引起受体细胞内源性α-syn聚集[22]。因此有理由认为，PD病人脑脊液外泌体中α-syn的含量虽然很低，但足以在疾病进展中起到关键作用。另一项研究在体外培养过表达α-syn的SH-SY5Y多巴胺能细胞系，利用免疫磁珠从细胞上清液中特异性分离外泌体，发现细胞上清液中大约75%的α-syn来源于外泌体[6]。在本实验中，通过免疫磁珠分离外泌体后，上清液中α-syn下降了大约30%。这些结果表明，外泌体α-syn在细胞外液中的比例可能与不同细胞类型有关，对比脑脊液，可能体外培养的神经细胞系上清中外泌体形式的α-syn比例更高。但无论细胞外液中外泌体α-syn的比例高低，由于在各种体液成分中容易获得，外泌体α-syn在包括PD在内神经变性疾病的发病机制、早期诊断和治疗策略中的作用都值得进一步关注。

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（本文編辑马伟平）