黑质区过表达TFEB对C57/BL6小鼠运动功能影响

刘琳　陈蕾蕾　谢俊霞

［摘要］目的探究黑質区过表达转录因子EB（TFEB）对C57/BL6小鼠运动功能的影响。方法8周龄雄性C57/BL6小鼠30只，随机分为2组，每组15只。采用脑立体定位注射方法，将携带有TFEB的腺相关病毒（AAV-TFEB）注射至实验组小鼠黑质区，对照组小鼠注射相同剂量的空载腺相关病毒（AAV-mCherry）。4周后，采用免疫荧光和免疫印迹方法检测小鼠黑质区是否高表达TFEB，利用旷场、转棒和爬杆实验评估高表达TFEB小鼠的运动功能变化。结果脑立体定位注射腺相关病毒4周后，可检测到小鼠黑质区高表达TFEB。旷场实验显示，实验组小鼠的运动总距离较对照组增加，差异具有统计学意义（t=2.776，P<0.05），两组小鼠通过中心区域次数差异无显著性（t=1.414，P>0.05）。转棒实验显示，两组小鼠运动疲劳状态差异无显著性（t=1.017，P>0.05）。爬杆实验显示，两组小鼠的运动协调能力差异无显著性（t=0.264，P>0.05）。结论黑质区高表达TFEB能够增强C57/BL6小鼠的持续运动能力。

［关键词］转录因子；黑质；运动活动；小鼠

［中图分类号］R338.2［文献标志码］A［文章编号］2096-5532（2023）03-0325-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.093［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230807.0920.004;2023-08-0716：36：25

EFFECTS OF OVEREXPRESSION OF TRANSCRIPTION FACTOR EB IN THE SUBSTANTIA NIGRA ON MOTOR FUNCTION IN C57/BL6 MICE  LIU Lin， CHEN Leilei， XIE Junxia （Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effects of overexpression of the transcription factor EB （TFEB） on motor function in C57/BL6 mice. MethodsThirty 8-week-old male C57/BL6 mice were randomly divided into two groups， with 15 mice in each group. The experimental group received stereotactic injection of an adeno-associated virus carrying the TFEB gene （AAV-TFEB） into the substantia nigra. The control group received injection of the same dose of an empty adeno-associated virus （AAV-mCherry）. After four weeks， the presence or absence of high TFEB expression in the substantia nigra was determined by immunofluorescence assay and Western blot. The motor function of mice with high TFEB expression was evaluated by using the open field， rotarod， and pole tests. ResultsHigh expression of TFEB was detected in the substantia nigra four weeks after stereotactic injection of AAV-TFEB. The open field test showed that the total distance of movement of the mice in the experimental group was significantly increased compared with that of the control group （t=2.776，P<0.05）， with no significant difference in the frequency of center square entries （t=1.414，P>0.05）. In the rotarod test， there was no significant difference between the two groups in fatigue resistance （t=1.017，P>0.05）. In the pole test， there was no significant difference in the motor coordination ability of the two groups （t=0.264，P>0.05）. ConclusionOverexpression of TFEB in the substantia nigra could enhance the persistent motor function of C57/BL6 mice.

［KEY WORDS］transcription factors; substantia nigra; motor activity; mice

帕金森病（PD）是第二大常见的与年龄相关的神经退行性疾病，其主要的临床症状为静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势不稳[1-4]。随着年龄的增加，不同的铁复合物会在与运动和认知障碍相关的大脑区域积聚[5]，造成PD病人的行為运动障碍，而溶酶体在细胞铁运输和体内铁平衡中起着关键作用[6-7]。转录因子EB（TFEB）是调节溶酶体再生和自噬的主要转录调节因子[8]。已有研究结果表明，高表达TFEB能够逆转溶酶体的功能，在神经退行性疾病中发挥神经保护作用[9-11]，是预防或者治疗PD的有效策略之一。目前，已报道的实验研究主要集中在TFEB如何影响溶酶体的生成及如何清除病理性蛋白聚集[12]，TFEB是否影响运动行为尚不清楚。本实验室前期研究表明，TFEB可能使细胞内铁储存能力增强，从而保护细胞免受铁死亡的影响[13]。本实验旨在评估TFEB对小鼠运动功能

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的影响，从而为防治PD的运动功能障碍提供实验依据。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物7周龄的SPF级C57/BL6小鼠30只，购于北京维通利华实验技术有限公司。小鼠每5只一笼，饲养于室温（21±2）℃、湿度（50±5）%、12/12 h昼夜循环光照条件下，可自由饮水和摄食，饲养到8周龄。

1.1.2主要试剂腺相关病毒（AAV）购于和元生物技术（上海）股份有限公司，加入1×PBS无菌缓冲液将空载AAV（AAV-mCherry）和携带有TFEB的AAV（AAV-TFEB）稀释到相同的滴度。TFEB抗体购于Proteintech公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体和羊抗兔二抗购于爱必信（上海）生物科技有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒购自康为世纪；酪氨酸羟化酶（TH）抗体购于默克（Millipore）生命科学有限公司。

1.2实验方法

1.2.1黑质区立体定位注射将小鼠放入动物麻醉机（瑞沃德）诱导盒中，输入异氟烷与空气（1∶1）的混合气体，当小鼠深度麻醉后，迅速将小鼠固定在脑立体定位仪上，调小异氟烷与空气输入量后持续供给。使用耳杆适配器固定小鼠头部，调节门齿的高度使小鼠头部平整，使耳杆适配器两侧读数一致。用剪刀剪去小鼠头顶的毛发，棉签蘸取碘附消毒后用手术剪剪开头部皮肤，将颅骨外侧暴露出来。用过氧化氢溶液和生理盐水擦拭头皮后，参照小鼠脑立体定位图谱，在台式双目体视显微镜（瑞沃德）下定位前囟和后囟，计算黑质区坐标。使用超微量注射器（World Precision Instruments）在两侧黑质区注射AAV，对照组注射AAV-mCherry，实验组注射AAV-TFEB，每侧黑质区注射200 nL，注射流量为1.0 nL/s，注射完成后留针10 min。退针后，用碘附消毒伤口，缝合并打耳洞做好标记，将小鼠放在电暖气旁等待苏醒，苏醒后送回动物房正常饲养，4周后进行行为学实验。

1.2.2旷场实验将高40 cm、底部边长40 cm、内壁为黑色且不透明的小鼠旷场反应箱，置于运动轨迹采集摄像头的正下方，镜头距离反应箱底部高度为2 m。打开动物运动轨迹采集软件（EthvisionXT 7）并设置相关参数后进行实验。整个实验在安静稳定的环境下进行。通过观察小鼠在旷场反应箱中运动总距离和通过中心区域次数对其自主运动能力进行评价。

1.2.3转棒实验测试仪器为Med Associates Inc公司生产的转棒仪，将小鼠放在匀速转动仪器上适应1 min，之后启动测试，仪器以4～40 r/min速度转动，记录小鼠在转棒上的持续运动时间，测试总时长为5 min。测试3次，每次间隔30 min以上，取平均值。

1.2.4爬杆实验爬杆装置（瑞沃德）为一根直径0.8 cm、长50 cm、顶部带有直径3 cm圆球的木杆，用医用胶带缠绕其表面，防止小鼠打滑，其底部带有金属底座，放置于长100 cm、宽50 cm的白色塑料盒中，在里面加入 2/3的新垫料。实验前1 d，对所有实验小鼠进行适应性训练，第2天正式实验时，将小鼠放置在杆的小球处，头部向下，记录小鼠向下运动到底部的时间。共进行3次实验，取平均值。

1.2.5免疫荧光染色病毒注射4周后，每组取6只小鼠，完全麻醉后迅速行腹腔灌注，断头取脑，用40 g/L多聚甲醛固定。沉糖使小鼠脑完全脱水下沉之后进行冷冻切片。切好的脑片置于0.01 mol/L PBS中，室温下在摇床上清洗10 min去除包埋剂。干净的脑片放入40 g/L多聚甲醛溶液中固定10 min，用0.01 mol/L PBS清洗3次，每次10 min，用封闭液封闭1 h，随后将脑片分别置于配制好的TH和TFEB一抗稀释液中，4 ℃摇床上孵育过夜；用0.01 mol/L PBS清洗3次，每次10 min，加入二抗稀释液，在室温下于摇床上避光孵育2 h；加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染色液，继续孵育5 min，用0.01 mol/L PBS清洗3次，每次10 min。将处理好的脑片平铺到干净的病理防脱载玻片上，用甘油封片，避光放置。最后用Olympus数字病理切片扫描系统荧光显微镜进行观察。

1.2.6免疫印迹法检测TFEB蛋白表达小鼠灌注取脑后，迅速取出两侧黑质组织，按照组织质量加入配制好的裂解液，在冰上裂解30 min，放入组织研磨仪中研磨，取出后静置30 min，放入提前预冷至4 ℃的离心机中，以12 000 r/min离心30 min，取上清，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。配制SDS-PAGE凝胶，在80 V恒电压下跑胶，恒电流300 mA 90 min转膜。转膜结束以后用50 g/L脱脂奶粉配制的封闭液封闭1 h。加入TFEB（1∶1 000）一抗，在恒温摇床上4 ℃孵育过夜。第2天用TBST洗膜3次，每次10 min。加入山羊抗兔（1∶10 000）的HRP-IgG二抗，室温下孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。加入发光液后应用美国UVP凝胶成像系统采集图像。用Image J软件分析条带灰度值。

1.3統计学处理

采用GraphPad Prism 7软件进行统计分析，实验结果以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1病毒在小鼠脑中的表达位置

脑组织免疫荧光染色结果显示，对照组和实验组的AAV荧光可以与TH的绿色荧光共定位，提示AAV可在黑质区的多巴胺能神经元内表达。

2.2TFEB在小鼠黑质区中的表达

免疫印迹结果显示，对照组和实验组小鼠黑质区组织中TFEB蛋白的表达水平分别为0.484 2±0.037 3和0.896 2±0.064 3（n=6）。与对照组相比，实验组小鼠黑质区TFEB蛋白表达水平明显上升，差异具有统计学意义（t=5.544，P<0.05）。提示脑立体定位注射AAV-TFEB至小鼠黑质区4周后，可在多巴胺能神经元内有效高表达TFEB。

2.3高表达TFEB对小鼠运动功能的影响

旷场实验结果显示，实验组小鼠的运动总距离较对照组增加，差异具有统计学意义（t=2.776，P<0.05），两组小鼠通过中心区域次数差异无显著性（t=1.414，P>0.05）。转棒实验结果显示，两组小鼠运动疲劳状态差异无显著意义（t=1.017，P>0.05）。爬杆实验结果显示，两组小鼠的运动协调能力差异无显著性（t=0.264，P>0.05）。见表1。

3讨论

PD的临床症状分为运动症状和非运动症状，运动症状是其典型表现[14-15]。而黑质多巴胺能神经元的丢失、α-突触核蛋白聚集和铁沉积这些PD的主要病理特征往往在运动障碍出现之前就已经形成[16-20]。铁参与大脑中的许多基本生物过程，包括氧气运输、DNA合成、线粒体呼吸、髓磷脂合成以及神经递质合成和代谢[5]。铁稳态是维持正常生理脑功能所必需的，而铁稳态的失调可以通过不同的机制引起神经毒性[5，21-22]。当铁稳态失调时，很容易诱发铁死亡，铁死亡是一种依赖于细胞内铁积累而引起毒性脂质过氧化物活性氧升高的非凋亡细胞死亡形式[23-25]。在PD病人中，大量的铁在脑区聚集，所产生的反应性物质能够诱发脂质过氧化，进而加剧氧化应激，诱导脑中多巴胺能神经元的丢失。以上研究表明，铁在神经系统中发挥着重要作用，调节铁的代谢或可成为防治PD的有效策略之一。

TFEB是碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子MiT/TFE家族的成员。MiT/TFE家族成员在很多细胞过程中都发挥关键作用，包括自噬-溶酶体生物发生[26-27]。有研究表明，高表达的TFEB能够促进溶酶体再生，而自噬和溶酶体通过降解铁蛋白参与铁死亡的诱导过程[6]。另有研究表明，海藻糖也可以通过TFEB促进自噬，改善多种神经退行性疾病模型中的疾病表型[28]。因此，TFEB是否可以通过影响脑内铁代谢从而影响PD的运动功能值得进一步探索。

本实验在C57/BL6小鼠黑质区脑立体定位注射AAV-TFEB 4周后，对小鼠进行行为学测试。爬杆实验用来评估运动协调能力，转棒实验用来评估运动疲劳，结果显示，两组小鼠运动协调能力和运动疲劳差异均无显著性。旷场实验用于观察小鼠在新环境中的自主运动行为，小鼠水平运动的总距离能够反映其运动能力，在中心区与外周区的通过次数和停留时间则反映其焦虑情况。本实验结果显示，高表达TFEB的小鼠无焦虑情况，但运动总距离显著增加，说明小鼠的运动能力增强，高表达TFEB可以调节小鼠的运动能力。结合已有研究结果，推测TFEB可能使细胞内铁储存能力增强，从而保护细胞免受铁死亡的影响，进而影响PD运动障碍的形成。

综上所述，TFEB能够调节小鼠的运动功能，但它是否对PD模型小鼠的运动功能障碍具有保护作用仍需要进一步研究。

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（本文編辑马伟平）