朝藿定B对BV2小胶质细胞炎症反应的作用及机制

胡子凡　谷雨　范育辰　戴玮　陈文芳

［摘要］目的探討朝藿定B对脂多糖（LPS）诱导的BV2小胶质细胞炎症反应的抑制作用及雌激素受体（ER）特异性阻断剂ICI 182，780的阻断效应。方法常规培养BV2小胶质细胞，加或不加朝藿定B、LPS、ICI 182，780处理，采用3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5二苯基溴化四唑（MTT）比色法检测细胞活力，实时聚合酶链反应检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）mRNA的表达。结果不同浓度朝藿定B对BV2小胶质细胞活力没有影响（P>0.05）。LPS可明显上调促炎因子TNF-α（F=10.64，q=9.157，P<0.001）和IL-6（F=25.25，q=12.630，P<0.001）mRNA的表达；1、10 μmol/L朝藿定B预处理均能明显抑制LPS诱导的TNF-α mRNA表达上调（q=4.655、5.408，P<0.05），10 μmol/L朝藿定B对LPS诱导的IL-6 mRNA表达有明显的抑制作用（q=4.696，P<0.05）。朝藿定B对LPS诱导的TNF-α和IL-6 mRNA表达的抑制作用可被ICI 182，780所阻断（F=12.53、28.71，q=5.318、4.684，P<0.05）。结论朝藿定B能够抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞促炎因子的表达，其机制可能与ER信号途径有关。

［关键词］朝藿定B；脂多糖类；炎症；受体，雌激素；小神经胶质细胞

［中图分类号］R338.2［文献标志码］A［文章编号］2096-5532（2023）03-0333-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.092［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230801.1834.004;2023-08-0211：03：43

ROLE AND MECHANISM OF EPIMEDIN B IN INFLAMMATORY RESPONSE IN BV2 MICROGLIA CELLS  HU Zifan， GU Yu， FAN Yuchen， DAI Wei， CHEN Wenfang （Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of Epimedin B on lipopolysaccharide （LPS）-induced inflammatory response in BV2 microglial cells and the blocking effect of the estrogen receptor （ER）-specific blocker ICI 182，780. MethodsBV2 microglial cells were routinely cultured and treated with or without Epimedin B， LPS， and ICI 182，780. MTT colorimetry was used to measure cell viability， and real-time PCR was used to measure the mRNA expression levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6）. ResultsDifferent concentrations of Epimedin B had no effect on the viability of BV2 microglial cells （P>0.05）. LPS significantly upregulated the mRNA expression levels of the proinflammatory factors TNF-α （F=10.64，q=9.157，P<0.001） and IL-6 （F=25.25，q=12.630，P<0.001）. Epimedin B pretreatment at concentrations of 1 and 10 μmol/L significantly inhibited the upregulated mRNA expression of TNF-α induced by LPS （q=4.655，5.408;P<0.05）， and Epimedin B at a concentration of 10 μmol/L significantly inhibited the LPS-induced mRNA expression of IL-6 （q=4.696，P<0.05）. The inhibitory effect of Epimedin B on the LPS-induced mRNA expression of TNF-α and IL-6 could be blocked by ICI 182，780 （F=12.53，28.71;q=5.318，4.684;P<0.05）. ConclusionEpimedin B can inhibit the expression of proinflammatory factors induced by LPS in BV2 microglial cells， which may be associated with the ER signaling pathway.

［KEY WORDS］Epimedin B; lipopolysaccharides; inflammation; receptors， estrogen; microglia

神經炎症是一种复杂的先天免疫反应，能够对病原体、受损细胞和中枢神经系统刺激物等有害刺激做出反应[1]，在中枢神经系统疾病发病中发挥着重要的作用，是神经退行性疾病发病的主要驱动因素[2-4]。在各种致炎因子的刺激下，与神经炎症相关的小胶质细胞被过度激活，释放促炎因子，诱导神经元损伤，使炎症反应加剧，进而加速某些神经退行性疾病的进程[5-7]。因此，有效抑制小胶质细胞的炎症反应是治疗中枢神经系统炎症的有益思路。淫羊藿作为传统中药，具有补肾壮骨、抗癌、抗抑郁、改善学习记忆等多种功效[8-10]。朝藿定B是淫羊藿总黄酮主要的活性成分，具有低毒的优势[11-12]。研究表明，朝藿定B具有调节炎症和骨保护等作用，其机制可能与雌激素受体（ER）有关[13-14]。但在神经系统，朝藿定B是否具有抗炎神经保护作用尚未见报道。本研究应用脂多糖（LPS）制备BV2小胶质细胞炎症

334青岛大学学报（医学版）59卷

模型，探讨朝藿定B对LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应的作用及其可能机制。现将实验结果报告如下。

1材料和方法

1.1主要材料

BV2小胶质细胞属于小鼠小胶质瘤细胞系，购自北京市协和医学院细胞资源中心；朝藿定B购自上海同田生物技术有限公司；LPS和ICI 182，780购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养液购自BI公司；青霉素/链霉素储存液购自新华制药厂，分装后-20 ℃保存备用；胎牛血清购自BI公司，分装后-40 ℃保存备用；3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5二苯基溴化四唑（MTT）购自国风生物公司，应用浓度为0.01 mol/L的PBS溶解，配制成5 g/L的母液；TRIzol试剂购自美国Life Technologies公司；聚合酶链反应（PCR）逆转录试剂盒购自美国TaKaRa公司；SYBR Green（Master Mix）购自诺维赞医疗科技有限公司；PCR引物由青岛蔚来生物科技有限公司设计并合成。

1.2细胞培养及分组

BV2小胶质细胞接种于培养瓶或孔板中，应用DMEM高糖培养液（内含体积分数0.01的青链霉素和体积分数0.10的胎牛血清），置于无菌培养箱（含体积分数0.05 CO2、37 ℃）中常规培养。

为观察不同浓度朝藿定B对细胞活力的影响，实验分为对照组、不同浓度（1、10、20 μmol/L）朝藿定B组、LPS（1 g/L）与不同浓度朝藿定B合用组。为观察不同浓度朝藿定B对LPS诱导的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）mRNA表达的影响，实验分为对照组（A组）、LPS组（B组）、1 μmol/L朝藿定B+LPS组（C组）、10 μmol/L朝藿定B+LPS组（D组）和20 μmol/L朝藿定B+LPS组（E组）。为验证ICI 182，780是否能阻断朝藿定B对LPS诱导的TNF-α和IL-6 mRNA表达的作用，实验分为对照组（a组）、LPS组（b组）、朝藿定B+LPS组（c组）和ICI 182，780+朝藿定B+LPS组（d组）。

1.3MTT法检测细胞活力

对BV2小胶质细胞悬液进行计数，调整细胞的密度为8×107/L，随后将细胞悬液均匀接种在96孔板中，每孔100 μL，置于含体积分数0.05 CO₂、37 ℃培养箱中培养24 h。培养至细胞融合度达到70%时，按照分组加入药物处理24 h。弃去细胞培养液，每孔加入5 g/L浓度的MTT溶液20 μL，继续避光培养4 h。吸去上清液，每孔加100 μL二甲基亚砜，使甲瓒晶体溶解。在低速摇床（80～90 r/min）上避光振荡10 min。最后用酶标仪在490 nm波长下检测各孔吸光度（A）值。

1.4实时聚合酶链反应（real-time PCR）方法检测TNF-α和IL-6 mRNA的表达

在显微镜下观察12孔板中的细胞融合度，达80％～90％时按分组进行加药处理。收集细胞，应用TRIzol法提取细胞总RNA，按照TaKaRa试剂盒说明书配制两步法反应体系，将RNA逆转录为cDNA。配制20.0 μL的PCR反应体系，包括Master Mix 10.0 μL、RNase free water 8.2 μL、上下游引物各0.4 μL以及cDNA 1.0 μL。将此反应体系放入real-time PCR仪中进行扩增。经40个循环完成扩增，采用2-△△CT法计算目的基因IL-6、TNF-α的相对表达量（以GAPDH为内参基因）。PCR扩增引物及其序列见表1。

1.5统计学处理

应用Graph Pad Prism 8.0软件进行统计学处理。所得结果以±s形式表示，多组比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），继以Turkey法进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度朝藿定B对BV2小胶质细胞活力的影响

MTT检测结果显示，对照组、不同浓度（1、10、20 μmol/L）朝藿定B组、LPS与不同浓度朝藿定B合用组的细胞存活率分别为1.000±0.035、1.006±0.025、1.014±0.024、0.984±0.032、1.006±0.036、1.021±0.034、0.999±0.032（n=3）。不同浓度朝藿定B对BV2小胶质细胞活力没有影响（P>0.05），表明实验所选的用药浓度对BV2小胶质细胞没有毒性。

2.2不同浓度朝藿定B对LPS诱导的TNF-α和IL-6 mRNA表达的影响

real-time PCR检测结果显示，与对照组相比，LPS組BV2小胶质细胞中TNF-α和IL-6 mRNA表达水平显著升高（F=10.64、25.25，q=9.157、12.630，P<0.001）；1、10 μmol/L朝藿定B预处理均能明显抑制LPS诱导的TNF-α mRNA表达上调（q=4.655、5.408，P<0.05），10 μmol/L朝藿定B对LPS诱导的IL-6 mRNA表达有明显的抑制作用（q=4.696，P<0.05）；1、20 μmol/L朝藿定B对LPS诱导的IL-6 mRNA表达有一定的抑制作用，但差异无统计学意义（P>0.05）。故选择10 μmol/L的朝藿定B进行后续实验。见表2。

2.3ICI 182，780对朝藿定B的阻断效应

real-time PCR检测结果显示，朝藿定B对LPS诱导的炎症反应的抑制作用可以被ICI 182，780所阻断（F=12.53、28.71，q=5.318、4.684，P<0.05）。见表3。

3讨论

ER分为核受体和膜受体两大类，经典ER即核受体包括ERα和ERβ，其表达具有组织和细胞特异性[15]。ER可由雌激素激活，被激活的ER发生易位，进而与靶DNA序列结合，调控基因表达[16]。ER参与多个系统的发育和功能维持，如生殖系统、大脑、心脏和肌肉骨骼系统等。除了核受体，以G-蛋白偶联雌激素受体（GPER）为代表的雌激素膜受体，可介导雌激素的快速非基因组效应，同样在机体正常功能维持和疾病治疗中发挥多种作用[17]。雌激素在相关疾病治疗过程中会导致其受体过度表达，引起组织损伤，进一步诱发自身免疫性疾病和肿瘤等，严重影响疾病的治疗和病人的身体健康[18]。因此，寻找补充或替代药物对于治疗相关疾病具有十分重要的意义。类雌激素是一种与雌激素结构并不完全相同，但能发挥雌激素功能的物质，二者的作用机制也并不完全相同。黄酮类化合物作为一种天然植物雌激素，具有类雌激素样作用，可改善认知障碍，调节免疫炎症[19-21]。在前期工作中我们鉴定了淫羊藿总黄酮指纹图谱中的21个黄酮类化合物，证实了淫羊藿总黄酮及其含量最高的活性成分淫羊藿苷能够对抗神经毒素对多巴胺能神经元的损伤[22]。研究表明，朝藿定B为含量第二高的单体成分，能够提高骨肉瘤细胞（UMR-106）骨保护素mRNA的表达，发挥骨保护功能，其机制可能与ER有关[14]。近年来研究显示，朝藿定B在MC3T3-E1细胞、泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型以及骨质疏松小鼠模型中均表现出很好的骨保护作用[10，12，23]。但朝藿定B能否抑制LPS诱导的小胶质细胞的炎症反应，其作用机制如何，目前尚未见报道。本研究结果显示，1、10 μmol/L的朝藿定B能够对抗LPS诱导的细胞炎症，10 μmol/L朝藿定B作用效果最明显，能够显著下调促炎因子TNF-α和IL-6 mRNA的表达。1 μmol/L药物浓度相对较低，并不能发挥良好的保护作用，20 μmol/L浓度相对较高，可能在一定程度上抑制了部分活性，导致保护效果有所降低。1、10 μmol/L浓度朝藿定B可显著降低LPS诱导的TNF-α mRNA的表达升高，而10 μmol/L的朝藿定B对IL-6 mRNA的作用效果更好，这可能是因为不同因子对炎症刺激的反应性有所不同，所以其mRNA的表达也会有一定差异。

我们最新的研究结果证实，朝藿定B能够对抗1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶及其活性神经毒性代谢物1-甲基-4-苯基吡啶诱导的多巴胺能神经元损伤，GPER介导的信号途径参与了朝藿定B的神经保护作用[24]。而朝藿定B能否通过经典ER基因组途径发挥抗炎作用，有待进一步探讨。本实验应用ER特异性阻断剂ICI 182，780预处理BV2小胶质细胞，结果显示朝藿定B的抗炎作用能够被ICI 182，780所阻断，提示ER核受体介导的信号途径参与了朝藿定B的抗炎作用。

综上所述，朝藿定B能够抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞促炎因子的表达，其机制可能与ER信号途径有关。

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（本文编辑马伟平）