Exendin-4及内源性GLP-1对大鼠海马CA3区神经元自发放电的调控

孙慧哲　刘翠　沈方帅　陈心怡　薛雁　陈蕾

［摘要］目的探究胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受体激动剂Exendin-4及内源性GLP-1对海马CA3区神经元自发放电的调控作用。方法利用在体细胞外单细胞电生理记录方法，观察三管微电极微压力注射10 μmol/L Exendin-4和10 μmol/L Exendin-9-39（GLP-1受体阻断剂）对大鼠海马CA3区神经元自发放电频率的影响。结果在记录到的22个海马CA3区神经元中，Exendin-4使17个神经元放电频率显著增高（t=6.286，P<0.01），平均升高（149.67±18.94）%，与生理盐水组相比差异有显著性（Z=3.571，P<0.01）。在记录到的14个海马CA3区神经元中，Exendin-9-39使10个神经元放电频率显著降低（t=7.968，P<0.01），平均降低（61.90±6.10）%，与生理盐水组相比差异有显著性（Z=3.145，P<0.01）。结论Exendin-4兴奋海马CA3区神经元，内源性GLP-1参与调节海马CA3区神经元自发放电。

［关键词］胰高血糖素样肽1；艾塞那肽；CA3区，海马；电生理学；大鼠

［中图分类号］R338.2［文献标志码］A［文章编号］2096-5532（2023）03-0353-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.074［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］https：//kns.cnki.net/kcms2/detail/37.1517.R.20230719.1612.002.html;2023-07-2014：53：18

ROLE OF EXENDIN-4 AND ENDOGENOUS GLUCAGON-LIKE PEPTIDE-1 IN REGULATING THE SPONTANEOUS DISCHARGE OF NEURONS IN THE HIPPOCAMPAL CA3 REGION OF RATS SUN Huizhe， LIU Cui， SHEN Fangshuai， CHEN Xinyi， XUE Yan， CHEN Lei （Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the role of the glucagon-like peptide 1 （GLP-1） receptor agonist Exendin-4 and endogenous GLP-1 in regulating spontaneous discharge of neurons in the hippocampal CA3 region. MethodsIn vivo extracellular single-unit recordings were used to observe the effect of three-barrel glass micro-electrode micro-pressure injection of 10 μmol/L Exendin-4 versus 10 μmol/L Exendin-9-39 （a GLP-1 receptor antagonist） on the spontaneous discharge frequency of neurons in the hippocampal CA3 region. ResultsAmong the 22 neurons recorded in the hippocampal CA3 region， 17 showed a significant increase in spontaneous discharge frequency caused by Exendin-4 （t=6.286，P<0.01）， with a mean increase of 149.67%±18.94%， which was significantly different from that in the saline group （Z=3.571，P<0.01）. Among the 14 neurons recorded in the hip-pocampal CA3 region， 10 showed a significant reduction in spontaneous discharge frequency caused by Exendin-9-39 （t=7.968，P<0.01）， with a mean reduction of （61.90±6.10）%， which was significantly different from that in the saline group （Z=3.145，P<0.01）. ConclusionExendin-4 can excite neurons in the hippocampal CA3 region， and endogenous GLP-1 is involved in regulating the spontaneous discharge of neurons in the hippocampal CA3 region.

［KEY WORDS］glucagon-like peptide 1; exenatide; CA3 region， hippocampal; electrophysiology; rats

胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是一种肠道激素，由肠道L细胞合成并分泌，可通过血-脑脊液屏障。而脑内GLP-1阳性神经元主要位于孤束核，其纤维投射广泛[1-3]。GLP-1受体是一种G蛋白耦联受体，广泛分布于包含海马在内的脑内核团[4]。有研究表明，激活脑内GLP-1受体可起到调节摄食、神经保护和抗炎作用，并参与调节突触可塑性。海马是学习记忆以及认知功能的重要调节中枢[5]。根据神经元形态及神经纤维的构成不同，海马可以分为CA1、CA2、CA3和CA4等区域。CA3区神经元的电活动参与编码空间工作相关记忆[5]。有形态学研究表明，海马CA3区高度表达GLP-1受体[2，6]。然而，GLP-1是否能调控海马CA3区神经元自发放电尚不清楚。本研究旨在利用在体电生理记录方法探讨GLP-1受体激动剂Exendin-4及内源性GLP-1对大鼠海马CA3区神经元自发放电的影响。现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1实验药品

Exendin-4和Exendin-9-39（GLP-1受体阻断剂）购于美国MedChemExpress公司，乌拉坦购于上海麦克林生化科技有限公司，乙酸钠和滂胺天蓝购于美国Sigma公司。

1.2动物处理

实验用鼠为健康成年雄性Wistar大鼠，体质量250～320 g，由济南市朋悦实验动物繁育有限公司提供。大鼠饲养于（23±1）℃、12 h昼夜循环、湿度50%～60%的实验环境中，可自由进食、饮水。在开始电生理实验前大鼠适应环境1周。严格按照实验医学伦理学要求，尽量减少动物的使用数量及在实验过程中的痛苦。

1.3在体细胞外电生理记录

腹腔注射乌拉坦1 g/kg麻醉大鼠，将大鼠放置在带有加热器的立体定位仪中，保持温度在36～38 ℃。根据大鼠脑图谱，在海马CA3区背侧部位进行开颅手术（前囟后3.6～3.8 mm，旁开3.4～4.0 mm）。通过多管微电极拉制器拉制出三管微电极，其记录电极中加入0.5 mol/L的乙酸钠和20 g/L的滂胺天蓝染料，另外两个管为给药电极，分别加入生理盐水和Exendin-4，或生理盐水和Exendin-9-39。生物电信号通过信号放大器和数模转化器进行扩大，用Spike 2软件记录并分析神经元放电数据。当电极尖端到达海马CA3区（颅骨外表面下2.5～3.2 mm）并且记录到稳定的神经元自发放电5 min后，通过生物细胞纳升注射器将上述药物注射到神经元表面，观察药物对神经元放电频率及放电模式的影响。神经元的基础放电频率为给药前120 s的平均频率，加药后的反应频率为加药后反应高峰处50 s的平均频率。如果给药后神经元放电频率的变化超过基础放电频率均数±2个标准差，则认为该神经元对该药物有反应，否则认为该神经元为无反应神经元[7]。

1.4统计学分析

采用SPSS软件进行统计学分析。所得计量数据以±s表示，神经元加药前后的放电频率比较采用配对t检验，两组神经元自发放电频率变化百分数比较采用曼-惠特尼秩和检验；对药物不同反应神经元放电模式的比较采用Fisher精确检验。P<0.05认为差异有显著性。

2结果

2.1Exendin-4对大鼠海马CA3区神经元自发放电的影响

在记录到的6个海马CA3区神经元中，微压力注射生理盐水后，其放电频率由（1.78±0.44）Hz变为（1.92±0.50）Hz，差异无统计学意义（t=1.277，P=0.274），放电频率增加（11.59±7.47）%。微压力注射10 μmol/L Exendin-4后，在所記录到的22个海马CA3区神经元中，Exendin-4显著兴奋17个神经元，其放电频率由（1.74±1.49）Hz增加到了（3.83±2.60）Hz，差异具有统计学意义（t=6.286，P<0.01），放电频率平均升高（149.67±18.94）%，与生理盐水组相比差异有统计学意义（Z=3.571，P<0.01）。Exendin-4对另外5个海马CA3区神经元的放电频率无明显影响，其放电频率由（1.77±0.48）Hz变为（1.95±0.45）Hz，差异无统计学意义（t=2.221，P=0.091）。

此外，本实验通过放电间隔直方图和自相关图对CA3区神经元的放电模式进行分析。共记录到两种CA3区神经元放电模式：簇状放电和不规则放电。在Exendin-4产生兴奋效应的17个神经元中，有11个神经元（64.7%）为簇状放电，6个神经元（35.3%）为不规则放电；在对Exendin-4无反应的5个神经元中，有3个神经元（60.0%）为簇状放电，2个神经元（40.0%）为不规则放电。CA3区神经元对Exendin-4的反应与神经元放电模式之间无明显相关性（P=0.833）。对每个神经元放电间隔直方图的自相关图进行分析，结果显示Exendin-4不改变神经元的放电模式。

2.2内源性GLP-1对海马CA3区神经元自发放电的影响

微压力注射生理盐水使所记录到的6个海马CA3区神经元放电频率由（1.95±1.72）Hz变为（2.09±2.22）Hz（t=0.497，P=0.674），平均变化（5.82±10.72）%。在所记录的14个海马CA3区神经元中，10 μmol/L的Exendin-9-39显著降低10个神经元的放电频率，其放电频率由（1.92±0.75）Hz降低至（0.83±0.65）Hz（t=7.968，P<0.01），平均降低（61.90±6.10）%，与生理盐水组相比差异有显著性（Z=3.145，P<0.01）。Exendin-9-39对另外4个海马CA3区神经元的放电频率无明显影响，其放电频率由（1.85±0.25）Hz变为（1.80±0.36）Hz（t=0.515，P=0.176）。

3討论

海马在记忆形成过程中占有核心地位，为信息的最初获取和储存提供了神经基础[8]。CA3区神经元是海马初级神经环路的重要组成部分，参与学习和记忆过程，尤其在突触传递调节及认知功能中发挥重要作用[6，9]。当海马CA3区锥体神经元发生变性及退变时，会引发神经退行性疾病，如阿尔茨海默病（AD）等。

GLP-1及其受体在大脑、胰腺、心脏、肌肉、肾脏中均有表达，具有广泛的生理功能。在人类和小鼠中GLP-1生理浓度下，GLP-1受体可以激活G-蛋白Gαs，进而激活腺苷酸环化酶，导致细胞内环磷酸腺苷水平增加[10-11]。GLP-1/GLP-1受体也可以激活G_αi/O和G_αq/1，导致磷脂酶C的激活以及二酰甘油和蛋白激酶C活性的增加[10，12]。人体临床试验和动物模型实验均表明，GLP-1参与能量代谢和摄食的调节，外周或中枢内的GLP-1可抑制摄食行为[13-14]。此外，在帕金森病（PD）动物模型中，GLP-1受体激动剂，如利西拉肽和利拉鲁肽，发挥明显的保护作用，可以改善PD模型小鼠运动能力[15]。另有研究报道，GLP-1受体激动剂利拉鲁肽可以抑制AD模型小鼠β淀粉样蛋白斑块的沉积，改善莫里斯水迷宫测试的认知功能，改善认知障碍[16-17]。此外，FARKAS等[18]近期研究发现，激活小鼠下丘脑GLP-1受体可增加促性腺激素释放激素神经元的放电频率，提示GLP-1可能通过调节神经元自发放电而参与调控摄食行为。形态学研究表明，GLP-1受体在CA3区有高水平的表达，然而Exendin-4对于海马CA3区神经元的直接电生理效应目前尚未见报道。本研究通过在体电生理实验观察到，微量注射Exendin-4可增强大鼠海马CA3区神经元的自发放电活动，这为脑内海马GLP-1/GLP-1受体系统提供了直接的功能性证据。

虽然没有形态学证据揭示孤束核GLP-1纤维直接投射至海马，但本研究观察到微量注射GLP-1受体阻断剂Exendin-9-39可以降低海马CA3区神经元的自发放电频率，这提示海马CA3区的内源性GLP-1参与调控神经元的兴奋性，增加其自发放电。以往也有报道称内源性GLP-1发挥重要功能。例如，有研究显示，摄食行为完成后，再次给予食物图片可以明显抑制参与食欲调节核团的活动，这种效应在很大程度上可以通过外周给予Exendin-9-39来阻断，这表明内源性GLP-1在摄食行为中起关键作用[19]。此外，有研究发现，内源性GLP-1可以调节十二指肠运动和胰腺分泌，减少骨吸收[20-21]。有电生理实验显示，GLP-1受体阻断剂Exendin-5-39可降低场兴奋性突触后电位衰减时间，抑制海马齿状回长时程抑制，调节海马的突触传递与突触可塑性，进一步揭示了内源性GLP-1的紧张性作用[22]。由上述研究可见，内源性GLP-1与神经元自发放电、食物摄取行为、突触传递和记忆形成都有着密切的联系，其重要性不可忽视。

有功能学实验研究结果表明，脑内直接给予Exendin-4可改善大鼠的空间记忆和工作记忆能力，抑制神经炎症的发生和Tau蛋白过度磷酸化，进而改善AD[23-24]。近期有研究表明，Exendin-4可以逆转PD模型小鼠黑质多巴胺能神经元的损伤，改善运动行为[25-26]。最近有研究指出，通过给予神经元温和的光遗传刺激或者兴奋性神经递质刺激，可以增加神经元兴奋性，起到保护神经元延缓神经元死亡的作用[27]。本研究结果显示，给予Exendin-4可直接兴奋海马CA3区神经元，提示脑内GLP-1对海马CA3区神经元的直接兴奋效应可能是其保护神经元及抗AD的途径之一。

综上所述，给予GLP-1受体激动剂Exendin-4可以增加海马CA3区神经元的自发放电频率，且内源性GLP-1亦参与调节海马CA3区神经元的兴奋性。本实验结果为进一步探究GLP-1/GLP-1受体系统可能作为学习与记忆相关疾病的潜在靶点提供了一定的理论基础和实验依据。

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（本文編辑马伟平）