p53基因突变对胶质母细胞瘤细胞Connexin 43表达影响

李建港　郇雪洁　焦倩　姜宏

［摘要］目的探究p53基因突变对胶质母细胞瘤细胞连接蛋白43（Connexin 43）表达的影响。方法培养胶质母细胞瘤U87细胞（p53野生型）与U251细胞（p53突变型），采用Western blotting方法分别检测两种细胞中p53蛋白与Connexin 43蛋白的表达水平。结果胶质母细胞瘤U251细胞中p53基因发生突变，与U87细胞相比，p53蛋白表达水平降低（t=2.948，P<0.05）；U251细胞中Connexin 43蛋白的表达水平显著高于U87细胞（t=2.771，P<0.05）。结论在胶质母细胞瘤细胞中，p53基因突变可能会提高Connexin 43蛋白的表达量。

［关键词］基因，p53；胶质母细胞瘤；细胞系，肿瘤；连接蛋白43

［中图分类号］R338.2［文献标志码］A［文章编号］2096-5532（2023）03-0361-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.091［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230802.0901.001;2023-08-0213：07：34

EFFECTS OF p53 GENE MUTATION ON CONNEXIN 43 EXPRESSION IN GLIOBLASTOMA CELLS  LI Jiangang， HUAN Xuejie， JIAO Qian， JIANG Hong （State Key Disciplines： Physiology （Incubation）， Department of Physiology， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effects of p53 gene mutation on the expression of Connexin 43 in glioblastoma cells. MethodsIn cultured glioblastoma U87 cells （wild-type p53 gene） and U251 cells （mutant p53 gene）， the expression of p53 protein and Connexin 43 protein was measured by Western blot. ResultsThe p53 protein level was significantly decreased in U251 cells compared with U87 cells （t=2.948，P<0.05）. The expression level of Connexin 43 protein in U251 cells was significantly increased than that of U87 cells （t=2.771，P<0.05）. ConclusionThe mutation of the p53 gene may increase the expression of Connexin 43 protein in glioblastoma cells.

［KEY WORDS］genes， p53; glioblastoma; cell line， tumor; Connexin 43

彌漫性胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，占中枢神经系统恶性肿瘤的80%[1]。世界卫生组织（WHO）根据其组织学和分子特征将它们归类为Ⅰ～Ⅳ级[2]。Ⅳ级胶质母细胞瘤（GBM）最具侵袭性，且中位生存期较差[3]。p53被认为是一个关键的肿瘤抑制基因，其功能障碍对肿瘤发生具有重要影响[4]。p53基因发生突变的肿瘤约占人类肿瘤的50%，一些p53突变体具有促进肿瘤发生发展的特性[5]。缝隙连接由连接蛋白组成，连接蛋白是一种跨膜蛋白，可组装成质膜中的通道[6]。缝隙连接信号负责相当大比例的细胞通讯，通过与相邻细胞形成的缝隙连接，可向邻近细胞递送和交换小分子肽、离子、内源核酸和其他细胞代谢物。因此，缝隙连接的异常表达可以改变细胞的新陈代谢，影响肿瘤的发生和进展[7]。连接蛋白43（Connexin 43）是目前发现细胞膜上表达最丰富的连接蛋白[8]。它能调节包括增殖在内的多种细胞功能活动[9]，其表达异常会引起癌症等多种病理变化[10]。有研究表明，Connexin 43可以促进胶质母细胞瘤的侵袭[11]。但胶质母细胞瘤中p53突变和Connexin 43的调节关系目前尚不明确。本实验选用p53野生型的U87细胞[12]和p53突变型的U251细胞[13]，检测Connexin 43的表达，旨在探讨p53基因突变对胶质母细胞瘤细胞Connexin 43表达的影响。

1材料与方法

1.1实验材料

本实验所用细胞为人胶质母细胞瘤U87细胞与U251细胞，均为贴壁生长的细胞，其中U87细胞为p53野生型细胞，而U251细胞则为p53突变型细胞。高糖DMEM细胞培养液购于以色列Biolo-gical Industries公司，胎牛血清购于北京全式金生物技术有限公司，青链霉素合剂购于北京索莱宝公司，p53抗体、Connexin 43抗体和GAPDH抗体均购于美国CST公司，羊抗兔IgG-HRP购于上海爱必信生物科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养将U87与U251细胞分别接种于含体积分数0.01青链霉素合剂和体积分数0.10胎牛血清的高糖DMEM培养液中，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中培养，待细胞融合度达80%～90%时，用胰酶消化2～3 min，加入等量的完全培养液终止消化，收集到15 mL的离心管中，以1 000 r/min离心5 min后丢弃上清液，加入新的完全培养液，用吸管轻轻吹打50～80次后充分悬浮细胞，转移到新的培养瓶中进行培养。

1.2.2Western blotting检测p53和Connexin 43蛋白的表达将U87细胞和U251细胞悬液按照每孔1×108/L的密度分别接种于6孔板中，待细胞融合度达到80%左右时将6孔板从培养箱中取出，每孔加入100 μL裂解液在冰上裂解30 min后提取两种细胞的蛋白。加入5×Loading Buffer，在水中煮沸10 min变性后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。每个凝胶孔的蛋白上样量为20 μg，用90 V的稳定电压进行电泳，用300 mA的稳定电流转膜90 min，根据所需目的蛋白的分子量对PVDF膜进行剪裁，然后以10 g/L的脱脂奶粉封闭90 min，分别加入p53抗体（1∶1 000）、Connexin 43抗体（1∶1 000）以及GAPDH抗体（1∶10 000）4 ℃孵育过夜。用TBST溶液漂洗3次（每次10 min）之后加入二抗（1∶10 000）室温孵育60 min，再用TBST溶液漂洗3次。用ECL化学发光液进行显影并拍照。使用Image J软件分析p53、Connexin 43和GAPDH条带的灰度值，目的蛋白的表达水平以p53、Connexin 43与GAPDH的比值表示。

1.3统计学方法

利用GraphPad Prism软件对数据进行统计学分析，计量资料以±s表示，两组比较采用两独立样本t检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2结果

2.1两种细胞中p53蛋白表达的比较

Western blotting结果显示，U87和U251细胞中p53蛋白的相对表达水平分别为1.280±0.227和0.570±0.080（n=6）。与U87细胞相比较，U251细胞中p53蛋白的表达水平明显降低，差异具有统计学意义（t=2.948，P<0.05）。见图1。

2.2两种细胞中Connexin 43蛋白表达的比较

Western blotting检测结果显示，U87细胞和U251细胞中Connexin 43蛋白的相对表达水平分别为0.370±0.096和0.820±0.131（n=6）。与U87细胞相比较，U251细胞中Connexin 43蛋白的表达水平明显升高，差异具有统计学意义（t=2.771，P<0.05）。见图2。

3讨论

胶质母细胞瘤是目前最常见和最具侵袭性的成人脑肿瘤，容易复发而且预后较差，5年生存率仅为5%[14]，主要原因是由于肿瘤的广泛浸润、细胞异质性以及放化疗抗性[15-17]。p53是如今研究最广泛的肿瘤抑制因子之一，它能调节各种细胞过程，包括细胞的侵袭与增殖[18]。在正常情况下，p53的活性维持在基础水平，但这种活性可能会在不同的应激条件下增加，例如不同类型的DNA损伤和致癌性损伤[19]。所以p53通路的失调被认为是肿瘤发生中的关键事件，在大多数的人类癌症中，p53出现下调或突变[5]。

有研究表明，在人类前列腺癌细胞中，Connexin 43蛋白的表达随着肿瘤细胞恶性程度的增加而升高，其在肿瘤内的分布发生变化，并与细胞侵袭之间存在相关性[20]。但也有研究发现，在胰腺导管腺癌细胞中，p53突变体可以通过促进Connexin 43蛋白的降解来增强细胞的迁移侵袭能力[21]。而在膠质母细胞瘤细胞中，Connexin 43的表达增加可以增强细胞的侵袭能力，敲除U87细胞中的Connexin43则会显著降低细胞的侵袭能力[22]。因此，胶质母细胞瘤细胞中依赖于Connexin 43的细胞通讯，可能是促进胶质母细胞瘤侵袭的一个重要因素。本实验结果显示，与U87细胞相比，U251细胞中Connexin 43蛋白的表达显著升高，表明p53基因的突变可能会导致胶质母细胞瘤细胞中Connexin 43蛋白的表达升高。有研究显示，U251细胞在体内比U87细胞具有更强的侵袭性和浸润性[23]，该特性是否与Connexin 43表达上调有关有待进一步研究。本研究后续将探讨p53突变调控Connexin 43的机制及与胶质瘤发展的关系，以期为靶向治疗胶质母细胞瘤提供实验数据。

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（本文編辑马伟平）