黄化茶树新品种‘茗冠’绿茶特征代谢产物分析

韩奥迪，李鑫磊，孔祥瑞，钟思彤，郭玉琼，单睿阳，游小妹，陈常颂,3,

（1.福建农林大学园艺学院，福建福州 350002；2.福建省农业科学院茶叶研究所/国家茶树改良中心福建分中心，福建福州 350012；3.国家土壤质量福安观测实验站，福建福安 355015）

中国是茶文化发源地，茶叶中富含挥发性芳香物质、茶多酚、氨基酸、咖啡碱等次生代谢产物[1]，这些代谢产物共同构成了茶叶独特的香气与滋味品质。近年来，具有特殊芽叶颜色的茶树由于其独特的表型和内含物而具有良好的经济和研究价值[2]。这些特殊的芽叶一般含有较高的游离氨基酸，所以用其鲜叶加工而成的绿茶多酚含量低，氨基酸含量高，使茶汤味鲜爽、苦涩味低。在浙江以‘白叶一号’为原料制成的安吉白茶氨基酸含量高、茶汤鲜爽，具有很高的经济价值[3]。‘白鸡冠’是福建省传统黄化地方茶树品种，在武夷岩茶中占有重要地位，叶色金黄，黄化持续时间长，成为茶树遗传育种的重要亲本[4]，更成为研究茶树叶色性状调控机理的重要材料[5]。但在福建，黄化茶树品种应用推广尚少，其中‘茗冠’茶树新品种是从‘白鸡冠’自然杂交后代中采用单株选育法育成的，属于小乔木型、中叶类、早生种，保留了其母本的黄化特征，且芽期早、产量高、花香型多茶类兼制。目前，已有大量研究通过对红茶、绿茶、乌龙茶等的香气和滋味品质组分分析，得出影响该茶叶品质特征的主要品质成分[6-9]，然而，关于黄化品种茗冠制得的绿茶品质特征的组分研究鲜有报道，且黄化品种较常规品种相比含有更高的氨基酸和更低的茶多酚，在滋味上较常规品种更加的鲜爽，因此本文采用黄化品种茗冠和常规品种福鼎大白鲜叶为原料，按照绿茶加工工艺分别制成茗冠绿茶和福鼎大白绿茶，采用GC-MS 和UPLC-MS 技术分析茗冠绿茶和福鼎大白绿茶之间的挥发性与非挥发性代谢物差异，探明茗冠品种制作绿茶的香气滋味特征品质，为进一步指导茗冠绿茶生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茗冠品种茶树一芽二叶鲜叶和福鼎大白茶树一芽二叶鲜叶 于2022 年4 月采自福建省农业科学院茶叶研究所福安茶叶基地；甲醇、乙腈、乙醇、癸酸乙酯 色谱纯，美国Sigma 公司；NaCl 分析纯，上海国药集团。

FD-56 真空冷冻干燥机 美国SIM；5424R 离心机 德国Eppendorf；MM400 研磨机 德国RETSCH；CBM30A 超高效液相色谱 日本岛津；4500QTRAP串联质谱（Tandem mass spectrometry，MS/MS） 美国SCIEX；Agilent 7890A/5975C GC-MS 联用仪美国安捷伦公司；SPME Arrow 固相微萃取装置CTC Analytics AG，KQ5200E 超声清洗仪 昆山舒美。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 茗冠品种茶树一芽二叶鲜叶和福鼎大白茶树一芽二叶鲜叶根据绿茶的加工方法（鲜叶摊放→杀青→揉捻→烘干）将两种茶树品种鲜叶分别制成茗冠绿茶（MGL）和福鼎大白茶绿茶（FDL）[10]，冻干、待测，每个处理均取3 份作为技术重复。

1.2.2 感官审评 根据GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》中绿茶审评法，由福建省茶叶质量监督检验站组织三名专业人员对茶样的外形、汤色、香气、滋味和叶底5 项因子分别进行审评术语描述。

1.2.3 样品前处理 挥发性组分：样品取自-80 ℃冰箱，用于液氮研磨和涡流混合均匀。每个样品在顶空瓶中称重至约1 g，分别加入饱和NaCl 溶液，10 μL 癸酸乙酯溶液（内标），全自动顶空固相微萃取HS-SPME 进行样本萃取，以供GC-MS 分析。

非挥发性组分：将3 g 茶叶样品放入5 mL 离心管中，在真空0.02 mbar、-50 ℃的冷冻干燥机中冷冻干燥。冻干后的样品用研磨机磨成均匀的粉末，过40 目筛，称取100 mg 粉末，溶于1.2 mL 70%甲醇提取液中。每30 min 抽吸30 s，重复6 次，然后在超声功率270 W，25 ℃超声下20 min，12000 r/min，离心10 min，将上清转入离心管，0.22 μm 滤膜过滤，保存于进样瓶中。对两种绿茶样品进行三次采样，制备后用超高效液相色谱-质谱联用技术进行分析。

1.2.4 仪器检测条件 GC×GC-TOF-MS：将120 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头在100 ℃下插入顶空瓶中振荡5 min，顶空萃取15 min。样品在250 ℃下解析5 min。色谱条件：DB-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为纯度不低于99.999%高纯氦气，恒定流速1.2 mL/min，注射口温度250 ℃，注射样品无分流，延迟溶剂3.5 min。程序升温：保持在40 ℃3.5 min，增加到100 ℃（10 ℃/min），增加到180 ℃（7 ℃/min），最后增加到280 ℃（25℃/min），保持5 min。质谱条件：电子轰击离子源（EI）：离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，质谱仪接口温度为280 ℃，电子能量为70 eV，扫描模式为全扫描模式（Scan），质量扫描范围为50～500 m/z。

UPLC-MS：色谱柱：（Agilent SB-C181.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相：A 相为超纯水，超纯水添加0.1%甲酸，B 相为乙腈；洗脱梯度：0.00 min，B 相占比5%，9.00 min 内，B 相占比线性增加至95%，1 min 维持在95%，10.00～11.10 min，B 相占比下降至5%，5%至14 min 平衡；流速0.35 mL/min；柱温40 ℃；进样量4 μL。质谱条件：离子源，涡轮喷雾；源温度为550 ℃；离子喷雾电压（IS）为5500 V（正离子模式）/-4500 V（负离子模式）；离子源气体I（GSI）设置为50 psi，气体II（GSII）设置为60 psi 和帘气（CUR）设置为25.0 psi，并且碰撞诱导电离参数设置为高。在三重四级杆（Triple quadrupole，QQQ）模式下使用10 μmol/L 聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准，在线性离子阱（LIT）模式下使用100 μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ 扫描采用MRM 模式，并设置中等碰撞气体（氮气）。通过DP 和CE 优化，完成了各个MRM 离子对的DP和CE。根据洗脱在每个时期内的代谢物，在每个时期监测一组特定的MRM 离子对。

1.3 数据处理

通过迈维（武汉）生物科技有限公司自建数据库和公共数据库，比较离子碎片模式、保留时间和m/z 值，对代谢产物进行鉴定。利用三重四级杆质谱的多反应监测（MRM）对代谢物进行量化，得到不同样品的代谢物质谱，并对其峰面积进行积分，最后得到不同样本之间的相同代谢物中的质谱峰进行积分校正。采用Excel 2003 进行数据处理；Simca14.1 对鉴定的代谢产物进行主成分分析及载荷图绘制。根据OPLS-DA 模型获得的变量重要性投影（Variable importance in project，VIP）评分，将P＜0.05，VIP≥1，fold change≥2 或fold change≤0.5 的代谢物定义为差异代谢物（Significant changed metabolites，SCMs）图表制作采用Graphpad prsim 8 软件进行柱状图绘制；热图绘制采用TBtools 软件进行热图绘制。

2 结果与分析

2.1 MGL 和FDL 感官品质评价

茗冠绿茶和福鼎大白绿茶感官品质特征如图1和表1 所示，茗冠绿茶（MGL）外形卷曲，汤色明亮，香气以嫩香、花香为主，滋味醇厚，叶底黄绿匀亮，具有花香，滋味醇厚。福鼎大白茶绿茶（FDL）外形较卷曲，汤色黄绿，香气以清香为主，滋味较醇爽，叶底嫩绿匀亮。

表1 MGL 与FDL 的感官审评Table 1 Sensory evaluation of MGL and FDL

图1 MGL（a）和 FDL（b）感官审评结果Fig.1 Results of sensory evaluation of MGL (a) and FDL (b)

2.2 茗冠绿茶特征挥发性组分分析

两种绿茶通过GC-MS 共鉴定327 种挥发性代谢产物，由MGL 与FDL 的主成分分析可知（图2），第一主成分的贡献率为74.66%，第二主成分的贡献率为15.95%，第一主成分与第二主成分一共占90.61%，表明这两个主成分占茶样挥发物的绝大部分，可以代表茶样整体挥发物情况。

图2 MGL 与 FDL 挥发性组分主成分分析Fig.2 Principle component analysis plots of MGL and FDL volatiles

一般认为主成分载荷图里的化合物越是远离起点对样品聚类的影响越大[11]，结合图2 和图3 可知，根据坐标位置可推测MGL 中代表性组分为位于第一主成分负轴的己酸叶醇酯、己酸-3-己烯酯、己酸-2-己烯酯、香叶醇、橙花叔醇、脱氢芳樟醇、丁酸叶醇酯、α-柏木烯、月桂烯、α-法呢烯。FDL 毛茶代表性香气组分位于第一主成分正轴的9-芴酮、顺式茉莉酮、L-α-松油醇、醋酸植物醇。

图3 MGL 与 FDL 挥发性组分载荷图Fig.3 Loading plots of MGL and FDL volatiles

2.3 茗冠绿茶主要挥发性组分相对含量差异分析

表2显示MGL 和FDL 之间主要挥发性组分相对含量的差异，MGL 中香气相对含量最高的化合物为己酸叶醇酯，占香气成分总含量6.57%。而其它的一些香气成分如香叶醇、己酸-3-己烯酯、脱氢芳樟醇、橙花叔醇、己酸-2-己烯酯、α-柏木烯、α-法呢烯、丁酸叶醇酯、月桂烯等相对含量均显著（P＜0.05）高于FDL。醇类物质主要呈现花香[12]，其中香叶醇具有典型玫瑰香、蔷薇香[13]，脱氢芳樟醇具有花果香[14]，橙花叔醇呈玫瑰及苹果香气[15]，促进了MGL 的花香持久。酯类化合物多呈果香，特别是其中的己酸叶醇酯是MGL 香气含量最高的化合物。其中，己酸叶醇酯呈现强烈弥散性梨香[16]，己酸-3-己烯酯具有玫瑰香、薄荷油香[17]，己酸-2-己烯酯具有水果香[17]，丁酸叶醇酯具有玫瑰花香[18]，均对MGL 花香有一定贡献。萜类物质是构成茶叶花果香的重要来源之一，带有甜香的α-柏木烯[19]，清香的α-法呢烯[20]，带有柠檬香、木香、花香的月桂烯[21]，这些香气活性成分为MGL 花香持久的重要物质基础。FDL 中相对含量较高的化合物为9-芴酮、顺式茉莉酮、L-α-松油和醋酸植物醇，带有花香，紫丁香的L-α-松油醇[22]和带有木本香的顺式茉莉酮[23]对FDL 的清香特征具有一定贡献。

表2 MGL 和FDL 中主要挥发性组分差异Table 2 Differences of important volatile components in MGL and FDL

?2.4 茗冠绿茶特征非挥发性组分

采用UPLC-MS 技术对茗冠和福鼎大白品种制成的绿茶非挥发性代谢组分进行测定，共获得1140 个代谢物，对上述组分进行主成分分析。如图4，第一主成分的贡献率为69.9%，第二主成分的贡献率为8.73%，第一主成分与第二主成分一共占78.63%。结果显示MGL、FDL 以第一主成分明显分离，说明样品间的代谢物存在显著差异。对上述非挥发性代谢组分进行差异化合物筛选P＜0.05、变量投影重要性VIP＞1、倍数变化fold change≥2 或fold change≤0.5 对代谢物进行筛选，共得到50 种具有差异的代谢物（表3）。其中儿茶素与儿茶素二聚体4 种，黄酮醇或黄酮糖苷33 种，游离氨基酸组分11 种，酚酸2 种。这些代谢物在含量上的差异，造就了MGL、FDL 各不相同的滋味特征。

表3 MGL 与FDL 非挥发性差异代谢物Table 3 Differential non-volatile metabolites identified in MGL and FDL

图4 MGL 与FDL 非挥发性组分主成分分析Fig.4 Principle component analysis plots of MGL and FDL non-volatiles

结合图4 和图5 可以看出，在载荷图第一主成分上，正轴分布着儿茶素组分（表儿茶素）、花青素组分（没食子酰原花青素B4）和部分黄酮醇或黄酮糖苷类组分（槲皮素3-O-新橘皮糖苷、槲皮素-3-O-（4-O-葡萄糖基）鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、山奈酚-3-O-（6-O-乙酰）葡萄糖苷、山奈酚-3-O-（6-丙二酰）半乳糖苷、杨梅素-3-O-半乳糖苷、杨梅素-3-O-半乳糖苷-3-O-鼠李糖苷、杨梅素-3-O-芸香糖苷、芹菜素-6-C-阿拉伯糖苷-8-C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-（2-葡萄糖基）阿拉伯糖苷、芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷）以及部分氨基酸组分（L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸），其为FDL 代表性组分。负轴分布着儿茶素组分（儿茶素、儿茶素没食子酸酯）、大部分黄酮醇或黄酮糖苷类组分（槲皮素-3-O-（2-O-鼠李糖基）芸香糖苷、槲皮素-3-O-（6-对香豆酰）半乳糖苷、槲皮素-3-O-（6-对香豆酰）葡萄糖苷、槲皮素-3-O-（6-没食子酰）半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-4-O-葡萄糖苷、槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-（2-O-乙酰）葡萄糖苷、山奈酚-3-O-（6-对香豆酰）葡萄糖苷、山奈酚-3-O-（6-没食子酰）半乳糖苷、山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-半乳糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-4-O-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-（2-木糖基）葡萄糖苷），氨基酸组分（L-谷氨酸、L-精氨酸、γ-氨基丁酸）以及4-O-对香豆酰奎宁酸、1-O-对香豆酰奎宁酸，其为MGL 代表性组分。

图5 MGL 与 FDL 非挥发性组分载荷图Fig.5 Loading plots of non-volatiles components of MGL and FDL

2.5 茗冠绿茶主要非挥发性组分相对含量差异分析

儿茶素是茶多酚的主要成分，其含量直接影响着茶叶的色、香、味[24]，图6 显示，差异儿茶素组分为儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG），在本研究中，儿茶素（C）和表儿茶素（EC）在MGL 中含量为1.04%和0.26%；在FDL 中含量为1.10%和0.41%，含量均无显著差异，表儿茶素没食子酸酯（ECG）在MGL 中含量为1.18%，在FDL 中含量为0.01%。前人研究表明，酯型儿茶素是主要的涩味成分，而非酯型儿茶素是茶汤苦味的主要成分[25-26]。在本研究中，MGL 儿茶素总量高于FDL，其苦涩味也应强于FDL，但滋味评价中MGL 苦涩味较低，说明茶汤的苦涩味不仅与儿茶素含量有关，还应该与其它物质如黄酮醇或黄酮糖苷、茶黄素等有关，茶汤中滋味物质之间的相互作用也会影响茶汤的滋味口感。原花青素是黄烷-3-醇的二聚或低聚物，具有良好的抗氧化活性和清除羰基的能力，在本次实验中，没食子酰原花青素B4 在MGL 中较高，这可能会赋予MGL 良好的抗氧化活性和清除自由基的能力。

图6 MGL 和 FDL 中 50 种特征差异代谢物含量的热图Fig.6 Heatmap analysis of 50 characteristic differential metabolites among MGL and FDL

黄酮醇或黄酮糖苷在茶汤中通常呈现较为柔和的涩感[27]，按照苷元分类，可分为槲皮素苷、山奈酚苷、芹菜素苷和杨梅素苷[28]。在本研究中，具有差异的黄酮醇或黄酮糖苷33 种，其中有20 个代谢物在MGL 中含量较高，分别为槲皮素-3-O-（2-O-鼠李糖基）芸香糖苷、槲皮素-3-O-（6-对香豆酰）半乳糖苷、槲皮素-3-O-（6-对香豆酰）葡萄糖苷、槲皮素-3-O-（6-没食子酰）半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-4-O-葡萄糖苷、槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-（2-O-乙酰）葡萄糖苷、山奈酚-3-O-（6-对香豆酰）葡萄糖苷、山奈酚-3-O-（6-没食子酰）半乳糖苷、山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-半乳糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-4-O-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-（2-木糖基）葡萄糖苷；有13 个代谢物在FDL 中含量较高，分别为槲皮素3-O-新橘皮糖苷、槲皮素-3-O-（4-O-葡萄糖基）鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、山奈酚-3-O-（6-O-乙酰）葡萄糖苷、山奈酚-3-O-（6-丙二酰）半乳糖苷、杨梅素-3-O-半乳糖苷、杨梅素-3-O-半乳糖苷-3-O-鼠李糖苷、杨梅素-3-O-芸香糖苷、芹菜素-6-C-阿拉伯糖苷-8-C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-（2-葡萄糖基）阿拉伯糖苷、芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷；黄酮糖苷因为苷元的不同表现出不同的含量变化，从图6可以看出，槲皮素苷和山奈酚苷在MGL 中含量较高，而大部分杨梅素苷和芹菜素苷则在FDL 中含量较高，整体来说，绝大部分黄酮醇和黄酮糖苷类化合物在MGL 中的含量高于FDL。

氨基酸类化合物占茶叶干重的1%～4%[29]。在茶叶加工中，氨基酸类化合物是茶汤鲜甜口感的来源和一些香气前体[30]。图6 显示，差异氨基酸组分为L-苯丙氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、γ-氨基丁酸。MGL 中仅L-谷氨酸、L-精氨酸、γ-氨基丁酸高于FDL，其中，L-谷氨酸可以产生类似鲜花的香气[31]，有助于提高茶叶的芳香质量，为绿茶提供强烈的“鲜味”，L-精氨酸是苦味氨基酸，可产生苦味和甜味，而γ-氨基丁酸在绿茶中也表现出较高的含量，不仅有助于滋味特征，而且具有类似肉类一样的气味，也是绿茶香气特征中的关键化合物[32]。这些氨基酸物质的相互作用对MGL 的滋味形成具有重要作用。而L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸低于FDL，其中带有苦味的L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸以及带有鲜味的L-天冬氨酸和L-谷氨酰胺对FDL 的滋味也有一定贡献。

酚酸是一类具有羧基和酚羟基的芳香族化合物，在茶叶风味方面也起着重要的作用[33]。茶叶中酚酸主要有没食子酸、咖啡酸、间双没食子酸、对香豆酸、茶没食子素等，它们的生物活性对茶叶非常的重要，同时也有着非常高的生物利用度[34]。图6 显示，差异酚酸组分为4-O-对香豆酰奎宁酸、1-O-对香豆酰奎宁酸，MGL 酚酸组分相对含量均高于FDL。

3 结论

不同茶树品种化学成分的差异导致所加工的绿茶呈现不同的感官品质特征。在本次实验中，茗冠品种制得的绿茶嫩香、花香较显，滋味醇厚；福鼎大白品种制得的绿茶清香，较醇爽。对茗冠绿茶和福鼎大白绿茶的挥发物进行进一步分析显示，在茗冠绿茶中，醇类、酯类、萜类化合物对茗冠绿茶香气有较大贡献，其中，己酸叶醇酯、香叶醇、己酸-3-己烯酯、脱氢芳樟醇、橙花叔醇、己酸-2-己烯酯、α-柏木烯、α-法呢烯、丁酸叶醇酯、月桂烯等物质在茗冠绿茶中含量较高。醇类物质（香叶醇，脱氢芳樟醇，橙花叔醇）具有花香，果香等特征；酯类物质（己酸叶醇酯、己酸-3-己烯酯、己酸-3-己烯酯、丁酸叶醇酯）具有玫瑰香、梨香等特征；萜类物质（α-柏木烯、α-法呢烯、月桂烯）具有甜香，清香、花香等特征，构成了茗冠绿茶嫩香、花香持久的特征。

滋味化学成分的含量和比例与绿茶的滋味品质密切相关，儿茶素与儿茶素二聚体、黄酮醇或黄酮糖苷、游离氨基酸组分、酚酸等物质的含量的高低直接影响着绿茶滋味的醇度、回甘等特征。对茗冠绿茶和福鼎绿茶的非挥发物进行进一步分析显示，茗冠绿茶和福鼎大白绿茶中内含成分具有较为明显的差异，茗冠绿茶中的儿茶素组分（ECG）、花青素组分、大部分黄铜醇和黄酮糖苷类（槲皮素-3-O-（2-O-鼠李糖基）芸香糖苷、槲皮素-3-O-（6-对香豆酰）半乳糖苷等）、酚酸类等化合物含量总体高于福鼎大白绿茶，非酯型儿茶素（C、EC）在两类茶叶中无显著差异，部分黄酮醇和黄酮糖苷类物质（槲皮素3-O-新橘皮糖苷、芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷等）、氨基酸类等化合物低于福鼎大白绿茶。