高苦茶碱茶树新品系‘苦茶6 号’茶类适制性研究

秦丹丹，陈俊丽，李 波，潘晨东，王秋霜，方开星，李红建，倪尔冬，姜晓辉，王 青，吴华玲

（广东省农业科学院茶叶研究所，广东省茶树资源创新利用重点实验室，广东广州 510640）

苦茶是我国特有一类茶树资源，其芽叶滋味极苦，多以野生状态分布于我国的云南、湖南、江西、福建、广东等地，当地多作为药物来饮用[1]，认为经常饮具有“治病、解毒、退火发汗”的效果[2]。因其独特的品质特征和保健功效，近年来，针对苦茶资源的鉴评[3-4]、保健功效评价[1,5]、遗传多样性分析[6-7]等相关研究日益增多，这些研究主要以江华苦茶[7-9]和富含苦茶碱的苦茶资源[10-11]作为研究对象。其中，富含苦茶碱的苦茶资源因具有较好的镇静安眠、改善肝脏脂肪化、抗炎止痛、抗抑郁等药理活性而受到广大研究工作者的关注[5]，也逐渐成为近年茶叶研究领域的热点。

目前，富含苦茶碱的苦茶资源的研究主要集中于高苦茶碱茶树的资源筛选[12]、代谢组学[13-14]、转录组学[15-16]、苦茶碱合成途径[17-18]等。然而，随着消费者对功能型茶树资源产品的关注，如何有效开发富含苦茶碱资源的适制茶类，并进行其不同茶类的品质特征的研究也是当前急需解决的问题，但鲜有相关研究报道。作者在前期筛选获得了一批高苦茶碱茶树资源[12]，基于此，本研究选择其中一个在产量、抗性、生长势综合表现优良的高苦茶碱新品系‘苦茶6 号’为原料，试制白茶、绿茶和红茶三大类茶，并通过感官审评结合品质成分分析综合评价该品系的适制性，挖掘该品系的潜力，以期为其合理开发利用提供更多的理论依据，也为推动苦茶资源快速产业化提供一些有益的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

‘苦茶6 号’ 由广东省农业科学院茶叶研究所自主选育的，茶树种植于广东省茶树种质资源库（广东，英德），分别于2020 年4 月（春茶）、8 月（夏茶）、9 月（秋茶）三个季节采摘‘苦茶6 号’茶树一芽二叶嫩梢，再经过不同制作工艺对采摘的鲜叶分别加工成绿茶、白茶、红茶三类茶；采摘‘苦茶6 号’和常规茶树对照品种（系）‘英红九号’、‘铁观音’、‘青心1 号’的一芽二叶鲜叶经微波杀青后，烘干制成蒸青样。

茚三酮、蒽酮 分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；福林酚 北京索莱宝科技有限公司；磷酸、甲醇 天津市富宇精细化工有限公司；标准品儿茶素（Epicatechin，EC）、儿茶素（Catechin，C）、表没食子儿茶素（Epigallocatechin，EGC）、表儿茶素没食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、儿茶素没食子酸酯（Catechingallate，CG）、没食子儿茶素没食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）、没食子儿茶素（Gallocatechin，GC）、咖啡碱、可可碱、苦茶碱纯度≥98%，成都艾博克生物科技有限公司；茶氨酸 纯度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；所有液相流动相有机溶剂均为国产色谱纯。

SHIMADZU LC-30A 型高效液相色谱 日本岛津公司；EPOCHZNS 型酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；Spring-R20 型实验室纯水系统 厦门锐思捷水纯化技术有限公司； SC-3616 型低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；GL224-1SCN 型电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HH-8 型数显恒温水浴锅 国华（常州）仪器制造有限公司；FiveEasyPlus FE28 型pH 计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 茶叶制备 采摘春季‘苦茶6 号’和常规茶树对照品种（系）‘英红九号’、‘铁观音’、‘青心1 号’的一芽二叶鲜叶经微波杀青后，85 ℃下干燥2 h 制成蒸青样，用于儿茶素组分、咖啡碱、苦茶碱、可可碱含量的测定。

春、夏、秋三季‘苦茶6 号’一芽二叶鲜叶采摘后分别按照下列工艺制成白茶、绿茶和红茶9 个成品茶。白茶制作工艺：鲜叶采摘后自然萎凋48 h，然后在110 ℃下初烘10 min，最后在85 ℃下干燥2 h。绿茶制作工艺：鲜叶采摘后，自然萎凋2 h，之后在200 ℃杀青锅中杀青5～6 min，取出摊凉后揉捻20 min，110 ℃初烘10 min，最后在85 ℃下干燥2 h。红茶制作工艺：鲜叶萎凋15～24 h 后揉捻1.5 h，自然发酵6～8 h，最后在85 ℃下干燥2 h。制成的成品茶用于感官审评及水浸出物、可溶性糖、茶多酚、儿茶素组分、咖啡碱、苦茶碱、可可碱、游离氨基酸和茶氨酸含量的测定。

1.2.2 感官审评 感官审评操作流程参考GB/T 23776-2018 《茶叶感官审评方法》[19]。审评方法：称取3 g 茶样，100 ℃沸水冲泡，绿茶4 min，红茶和白茶5 min，由5 名专业审评人员对样品进行密码审评。审评结果采用评语与评分结合加权评分法，对茶叶外形、汤色、香气、滋味和叶底五因子进行品质评价。

1.2.3 水浸出物、可溶性糖的测定方法 水浸出物测定采用GB/T 8305-2013《茶 水浸出物测定》；可溶性糖含量测定则采用蒽酮比色法[20]。

1.2.4 茶多酚和儿茶素组分的测定方法 茶多酚含量测定采用GB/T 8313-2018 《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》。

儿茶素组分（EGCG、EGC、GC、EC、GCG、C、ECG、CG）含量采用高效液相色谱仪（High performance liquid chromatography，HPLC）进行测定[13]，稍作改动。将0.2 g 茶粉用70%甲醇提取两次，定容到10 mL 容量瓶，吸取1 mL 提取液通过0.45 μm 有机相滤膜液到液相色谱样品瓶。HPLC条件包括：色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，5 μm）；柱温35 ℃；流速为1 mL·min-1，检测波长为280 nm；进样量为10 μL，流动相A：0.05%磷酸水溶液，流动相B：100%乙腈。流动相A 的洗脱梯度为0～30 min，93.5%～84%；

30～34 min，84%～80%；34～39 min，80%；39～40 min，80%～93.5%，40～45 min，93.5%。用标准品绘制标准曲线，计算儿茶素组分含量。

1.2.5 咖啡碱、苦茶碱、可可碱的测定方法 咖啡碱、可可碱、苦茶碱含量采用HPLC 进行测定[13]，稍作改动。将0.2 g 茶粉用70%甲醇提取两次，定容到10 mL 容量瓶，吸取1 mL 提取液通过0.45 μm 有机相滤膜液到液相色谱样品瓶。HPLC 条件包括：色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，5 μm）；柱温 35℃；流速为 1 mL·min-1，检测波长为280 nm；进样量为10 μL，流动相A：0.05%磷酸水溶液，流动相B：100%乙腈。流动相A 的洗脱梯度为0～30 min，93.5%～84%；30～34 min，84%～80%；34～39 min，80%；39～40 min，80%～93.5%，40～45 min，93.5%。用标准品绘制标准曲线，计算咖啡碱、可可碱、苦茶碱含量。

1.2.6 游离氨基酸和茶氨酸的测定方法 游离氨基酸总量测定采用GB/T 8314-2013《茶 游离氨基酸总量的测定》。

茶氨酸检测采用邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）柱前衍生法，采用HPLC 进行含量测定，检测方法参照文献方法[21]略作修改。色谱柱Agilent C18（4.6 mm×100 mm，5 μm），柱温40 ℃，检测波长338 nm。流动相A 为：40 mmol·L-1Na2HPO4，pH7.8，流动相B 为：乙腈∶甲醇∶水=4.5∶4.5∶1，流速为1.5 mL·min-1。流动相A 的洗脱梯度为：0～13.4 min，93.5%～43%；13.4～15 min，0%；15～15.5 min，0%～93.5%；15.5～18.0 min，93.5%。用标准品绘制标准曲线，计算茶氨酸含量。

1.3 数据处理

实验数据采用3 次重复取平均值，并采用GraphPad Prism8.0.2 软件进行显著性差异分析与柱形图绘制。

2 结果与分析

2.1 鲜叶主要生物碱和儿茶素含量分析

选择春季‘英红九号’（大叶种）、‘铁观音’（中叶种）、‘青心1 号’（小叶种）3 个常规茶树品种（系）作为对照，与‘苦茶6 号’的生物碱及儿茶素组分含量进行比较分析，结果如图1 和图2 所示。高苦茶碱新品系‘苦茶6 号’与其他3 个茶树品种（系）的生物碱和儿茶素含量差异较大，其中‘苦茶6 号’的苦茶碱的含量显著高于其他品种（系）（P＜0.05），而可可碱和咖啡碱含量低于其他茶树品种（系）。此外，‘苦茶6 号’的儿茶素总含量最高，占干物质总量的27.56%，远高于‘英红九号’（17.03%）、‘铁观音’（14.61%）、‘青心1 号’（9.94%），进一步对儿茶素组分分析表明，‘苦茶6 号’的EGCG、EGC 含量显著高于其他对照品种（系）（P＜0.05），其中EGCG 的含量高达18.52%，其次是EGC（4.65%）。由此可见，‘苦茶6 号’与常规茶在儿茶素和生物碱组成比例上存在较大差异，其中‘苦茶6 号’具有高含量的苦茶碱、EGCG 和EGC。

图1 不同茶树品种（系）蒸青样生物碱含量Fig.1 Contents of alkaloids among different tea cultivars (lines)

图2 不同茶树品种（系）蒸青样儿茶素含量Fig.2 Contents of catechins among different tea cultivars (lines)

2.2 不同季节不同茶类感官审评

参照GB/T 23776-2018《茶叶感官审评方法》，获得‘苦茶6 号’不同季节绿茶、白茶和红茶的感官审评结果（表1，图3）。

表1 ‘苦茶6 号’成品茶感官审评结果Table 1 Sensory evaluation results of Kucha No.6 among different tea types

图3 ‘苦茶6 号’成品茶感官审评结果Fig.3 Sensory evaluation results of Kucha No.6 among different tea types

‘苦茶6 号’制成的白茶根据季节不同干茶颜色偏灰绿或黄绿色；汤色呈黄色或深黄色；香气以秋季香气最优，春季、夏季呈药香，秋季则花香清高；口感醇厚鲜爽，但茶汤滋味较苦，各季节苦味程度相近；叶底为黄绿或灰绿色。

‘苦茶6 号’制成的绿茶根据季节不同干茶颜色偏青褐或青绿色，条索较紧细；汤色呈黄绿色或绿黄色，明亮；春季、秋季香气呈明显花香，夏季则以豆香为主，其中秋季香气最优；口感醇厚鲜爽，茶汤滋味苦，其中春季绿茶滋味在所有茶样中最苦，且绿茶滋味苦味大于白茶和红茶；叶底黄绿或嫩绿软亮。

‘苦茶6 号’制成的红茶品质较好，不同季节干茶颜色为乌黑或乌褐色，条索紧结带金毫；汤色橙红明亮；具有甜香浓郁、滋味醇厚鲜爽的特点，与绿茶和白茶滋味相比，红茶苦味程度最低，其中春季苦味程度高于夏、秋两季。

2.3 成品茶水浸出物、可溶性糖含量分析

不同季节‘苦茶6 号’白茶、绿茶和红茶的水浸出物、可溶性糖含量如图4 所示。总体来看，春季和夏季加工成的红茶，其水浸出物和可溶性糖含量均低于白茶和绿茶。

图4 ‘苦茶6 号’成品茶水浸出物（A）及可溶性糖（B）含量Fig.4 Contents of water soluble extracts (A) and soluble sugar(B) of Kucha No.6 among different tea types

由图4A 可看出，‘苦茶6 号’不同茶类水浸出物三季平均值含量中绿茶（49.86%）最高，白茶（48.94%）次之，红茶最低（44.98%），由此可见同一品种不同茶类水浸出物含量随着加工工艺发酵程度的加深而降低，这与时鸿迪等[22]报道的结果相一致。而不同茶类的水浸出物含量在三个季节的表现趋势不一致：白茶为春季＞夏季＞秋季，绿茶和红茶为秋季最高。

从图4B 可知，‘苦茶6 号’各茶类中春季样品的可溶性糖含量均显著低于夏、秋两季（P＜0.05），感官审评结果也表明各茶类中春季样品的苦味程度高于其他两个季节，说明低含量的可溶性糖可能是春季茶样苦味较重的主要原因之一。此外，白茶可溶性糖三季平均值（3.25%）大于绿茶（3.15%）和红茶（2.94%），这与杨双旭等[23]的研究结果一致，说明同一品种可溶性糖含量与其采摘季节及加工工艺密切相关。

2.4 成品茶茶多酚及儿茶素组分含量分析

由图5 可看出，‘苦茶6 号’成品茶茶多酚在绿茶中含量最高（三季平均值26.94%），且随着氧化程度的增加，茶叶中茶多酚的含量不断减少，红茶（三季平均值20.82%）中的茶多酚含量最低，且在每个季节不同茶类的含量变化趋势一致，说明茶多酚的含量与其加工工艺有很大的关联，红茶的发酵工艺促进了茶多酚转化为茶黄素、茶红素及茶褐素，这是导致红茶中茶多酚含量降低的主要原因，而绿茶杀青过程破坏鲜叶酶的活性，阻止多酚化合物的酶促氧化，致使绿茶的茶多酚含量更高。此外在白茶和绿茶中，茶多酚含量均表现为春季＞夏季＞秋季，这与感官审评中茶汤苦味变化趋势一致，说明茶多酚含量对茶汤的苦味程度具有重要贡献。

图5 ‘苦茶6 号’成品茶茶多酚含量Fig.5 Contents of tea polyphenol of Kucha No.6 among different tea types

儿茶素是茶多酚类物质的主要组成成分，与茶汤的浓度、滋味密切相关；此外，儿茶素同时具有苦味和涩味，是茶叶苦涩味的主要贡献物质，但苦味强于涩味[4,24]。本研究对‘苦茶6 号’成品茶8 种儿茶素单体（GC，EGC，C，EC，EGCG，GCG，ECG，CG）进行了测定，结果见表2。儿茶素总量以绿茶最高（22.41%～25.86%），白茶次之（16.11%～17.52%），红茶最低（3.16%～5.24%），这与茶多酚含量变化趋势一致。从儿茶素组分含量来看，不同茶类中GC、EGC、EC、EGCG、ECG 的含量与儿茶素总含量变化规律一致；8 种儿茶素单体均以绿茶含量最高，除CG 和GCG 外，其他儿茶素单体含量均为白茶＞红茶。由此看出，加工工艺对儿茶素含量影响较大，随着茶叶加工工艺中发酵程度的增加，儿茶素总含量逐渐降低（绿茶＞白茶＞红茶），红茶儿茶素总量显著低于绿茶和白茶（P＜0.05），其中儿茶素单体GC、EGC、EC、EGCG 和ECG 含量也显著下降（P＜0.05）。相关研究表明，ECG 和EGCG 是茶叶加工过程中形成茶黄素的主要前体[25]，因此推断在红茶加工过程中ECG、EGCG 在多酚氧化酶的催化下生成茶黄素，从而导致红茶儿茶素总含量显著低于其他茶类；而绿茶经杀青工艺后大部分酶失活，阻止了进一步酶促氧化反应的发生，因此儿茶素总量的保留是所有茶类中最高的；而白茶属于轻发酵茶，含量处于绿茶和红茶之间。此外，从表2 数据还可以看出，不同茶类中EGCG 含量最高，其次为EGC 和ECG，其中绿茶三季EGCG 平均值含量最高，达17.71%，其次为白茶（13.47%），而红茶最低（2.42%）。相关研究表明，8 种儿茶素中ECG 的苦涩味阈值最低，EGCG 次之[26]，可推断本研究中高含量的EGCG 和ECG 对绿茶和白茶的苦味具有重要贡献。

表2 ‘苦茶6 号’成品茶儿茶素组分含量（%）Table 2 Contents of catechins components of Kucha No.6 among different tea types (%)

2.5 成品茶嘌呤生物碱含量分析

在常规茶树品种中，嘌呤生物碱主要以咖啡碱为主，占茶叶干重的2%～4%，其次为可可碱约0.05%，而绝大部分苦茶中主要嘌呤生物碱为苦茶碱，咖啡碱次之[27]，高含量的苦茶碱也是苦茶滋味较苦的主要原因之一[3]。

‘苦茶6 号’不同茶类苦茶碱的含量如图6A 所示，同一茶类不同季节苦茶碱含量变化规律为春季＞秋季＞夏季，绿茶和红茶均存在显著性差异（P＜0.05），这与感官审评中不同季节苦味程度变化趋势一致，由此说明苦茶碱的含量对茶汤苦味程度具有重要的贡献，且季节对苦茶碱含量影响显著。此外，春季和秋季不同茶类中苦茶碱含量变化规律均为白茶＞红茶≥绿茶，且除春季白茶和红茶、秋季绿茶和红茶之间苦茶碱含量差异不显著外（P＞0.05），其他同一季节不同茶类的苦茶碱含量均存在显著性差异（P＜0.05），说明季节和加工工艺对苦茶碱含量均有不同程度的影响。

图6 ‘苦茶6 号’成品茶苦茶碱（A）、咖啡碱（B）和可可碱（C）含量Fig.6 Contents of theacrine (A), caffeine (B) and theobromine(C) of Kucha No. 6 among different tea types

咖啡碱与茶汤的苦味密切相关，对茶汤滋味起到协调作用，此外它还可与EGCG 之间产生协同效应，增强彼此的苦涩味[28]。由图6B 可看出，‘苦茶6 号’不同茶类咖啡碱含量三季平均为白茶＞红茶＞绿茶，与苦茶碱变化趋势一致，且除秋季绿茶和红茶的咖啡碱含量差异不显著外（P＞0.05），其他同一季节不同茶类的咖啡碱含量均存在显著性差异（P＜0.05），与李鑫磊等[29]、卢莉等[30]的研究结果相一致；此外还可以看出绿茶、白茶、红茶咖啡碱的含量均为秋季≥春季＞夏季，说明季节和加工工艺对苦茶碱含量均有不同程度的影响。

可可碱的含量（图6C）远低于苦茶碱和咖啡碱，其中绿茶的含量高于红茶和白茶，推测加工工艺对可可碱含量的影响较大；此外，魏沙沙等[31]研究表明可可碱与苦度值呈正相关，说明可可碱对‘苦茶6 号’不同茶类产品的苦味具有积极的贡献作用。

2.6 成品茶游离氨基酸、茶氨酸及酚氨比分析

游离氨基酸大多具有鲜爽、鲜甜滋味，对茶叶滋味以及香气的形成具有重要作用[32]。由图7A 可看出，‘苦茶6 号’白茶三季游离氨基酸含量平均值（4.24%）含量高于绿茶（3.86%）和红茶（4.07%），但不存在显著性差异（P＞0.05）；同一茶类中均为秋季的氨基酸含量最高。相关研究也发现同一品种加工成的不同茶类，白茶的氨基酸含量最高，这可能与白茶加工工艺密切相关，高含量的氨基酸可能来源于白茶长时间萎凋过程中，内源性蛋白酶被激活，催化水解蛋白质生成多种游离氨基酸，从而增加游离氨基酸含量[22,33-34]。

图7 ‘苦茶6 号’成品茶游离氨基酸（A）和茶氨酸（B）含量Fig.7 Contents of free amino acids (A) and theanine (B) of Kucha No.6 among different tea types

茶氨酸是茶叶中的特有氨基酸，也是茶叶游离氨基酸的主要组分。图7B 可看出不同季节绿茶的茶氨酸含量均显著高于其他两个茶类（P＜0.05），与游离氨基酸含量变化趋势不一致，这可能是因为不同茶类氨基酸组分组成比例存在差异造成；从季节上来分析，除制成的绿茶茶氨酸含量是春季最高外，白茶与红茶的茶氨酸含量均为夏季＞秋季＞春季，且夏季含量均显著高于其他两季（P＜0.05）。说明加工工艺及季节对茶氨酸含量均有较大影响，且茶氨酸与总游离氨基酸的变化趋势并不一致。

酚氨比是茶多酚总量与游离氨基酸总量的比值，该指标常作为衡量茶汤滋味的协调性，比值低品质较优，比值较高苦涩味明显[35]。从图8 可以看出，同一季节不同茶类的酚氨比最高的均为绿茶，其次是白茶和红茶；此外还发现不同茶类酚氨比均为春季＞夏季＞秋季，春季绿茶最高为7.46，秋季红茶最低为3.77；该结果与表2 感官审评结果相一致，酚氨比低的红茶苦味程度低于绿茶和白茶，且不同茶类春季样品的苦味程度高于其他两个季节。

图8 ‘苦茶6 号’成品茶酚氨比Fig.8 Phenol-ammonia ratio of Kucha No.6 among different tea types

3 结论

本研究以自主选育的高苦茶碱茶树新品系‘苦茶6 号’为原料，分别试制白茶、绿茶和红茶。感官审评结果表明：‘苦茶6 号’制成的白茶、绿茶和红茶的茶汤均有不同程度的苦味，春季苦味最重，其中红茶的苦味程度远低于绿茶和白茶；此外，秋季的白茶、绿茶和红茶香气较优，其中白茶和绿茶花香清高，红茶甜香持久，春季香气次之。品质成分分析结果表明，绿茶水浸出物最高为47.62%～52.98%，可溶性糖含量白茶最高为2.65%～4.01%；茶多酚和儿茶素总含量与其加工工艺密切相关，绿茶茶多酚含量高达25.84%～28.61%，而红茶含量仅为17.64%～22.85%；此外苦味阈值较低的EGCG 和ECG 在绿茶和白茶中的含量较高，显著高于红茶中的含量（P＜0.05），高含量的茶多酚、儿茶素对绿茶和白茶的苦味具有重要贡献；季节和加工工艺对苦茶碱和咖啡碱含量具有不同程度的影响，且同一季节不同茶类中苦茶碱和咖啡碱含量均为白茶＞红茶＞绿茶；绿茶的茶氨酸含量最高（1.01%～2.05%）。

综上，儿茶素总量、EGCG、EGC、茶多酚等与苦味紧密相关的组分在绿茶和白茶中的含量显著高于红茶，致使红茶的苦味程度远小于绿茶和白茶；此外，不同茶类春季样品中苦茶碱含量和酚氨比均显著高于其他两季，致使春季茶样滋味苦味程度高于夏季和秋季。同时结合感官审评和品质分析结果认为，富含高苦茶碱的茶树新品系‘苦茶6 号’具有较好的开发空间，更适合制作红茶，因其在保留高含量苦茶碱的同时还具有甜香浓郁、滋味醇厚鲜爽的特点；而绿茶和白茶虽苦味重，但花香清高且较好地保留了苦茶碱、EGCG 等保健功能成分，可用此来开发日用品、功能型饮品等深加工产品，丰富高苦茶碱苦茶产品的种类，提升其经济价值。本文深入研究了高苦茶碱茶树新品系‘苦茶6 号’的多茶类加工适制性，为苦茶资源的研究提供更多的参考，并为苦茶的开发与利用提供科学依据。