TLR-2、TNF-α与输卵管妊娠的相关性研究

徐海花,林冠,孙蓬明

异位妊娠是妇产科常见的急腹症,也是早期妊娠相关死亡的最常见原因。异位妊娠中95%为输卵管妊娠[1],其中以输卵管壶腹部妊娠最多见。目前对于输卵管妊娠的发病机制仍不明确,多数学者认为输卵管炎症是其主要病因。Toll样受体(Toll like receptor,TLR)是一类进化保守的膜式识别受体,TLR分子主要表达于固有免疫细胞(如单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞)和与外界环境直接接触的机体上皮细胞(如皮肤、胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道等)上,为宿主防御微生物的第一道免疫防线。近年来研究发现TLR分子与炎症密切相关,目前在TLR分子家族中,对TLR-2和TLR-4的研究最多;但TLR-2在妊娠状态下的输卵管中的表达情况研究报道甚少。有研究表明TLR异常表达及其诱导产生的炎症因子可能参与了输卵管妊娠的发病[2-3]。本文通过检测输卵管壶腹部妊娠和宫内足月妊娠不同部位的输卵管组织TLR-2 mRNA表达水平、外周血血清肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的浓度,探讨TLR-2、TNF-α与输卵管妊娠的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年10月至2018年3月福建省妇幼保健院收治的30例输卵管壶腹部妊娠的患者为输卵管妊娠组,该组病例术前未进行药物保守治疗,术后病理证实为输卵管壶腹部妊娠。另选同期30例足月妊娠无合并症的孕妇作为宫内妊娠组,入院剖宫产的同时要求行输卵管结扎,肉眼外观正常输卵管。所选研究对象均为自然受孕,手术前3个月内均未使用激素、抗生素治疗,患者签署知情同意书。研究经本院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂

TNF-αELISA试剂盒(北京义翘神州公司),酶标分析仪RT-6100(深圳雷杜生命科学公司),Trizol 试剂 (美国Ambion公司),电动组织研磨器(北京天根生化科技公司),逆转录试剂盒(美国Promega公司)、荧光定量PCR试剂盒(日本 Ta Ka Ra 公司),荧光定量 PCR 仪 LightCycler 480 II(瑞士 roche 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 血清TNF-α浓度检测 研究对象入院时抽外周静脉血2 mL置入EDTA抗凝紫色头盖管,将所收集血液置于低速离心机1 000 g,离心20 min,移除悬浮颗粒并吸取分离所得血清,立即进行分析或者将样本分装置于-20℃储存。采用 ELISA 法检测血清TNF-α的浓度,在ELISA检测仪上于450 nm处,以空白对照调零后测各孔的 OD值,进而换算出TNF-α浓度。

1.3.2 采用RT-PCR技术检测TLR-2 mRNA表达 通过手术采集输卵管壶腹部妊娠组的输卵管分为胚胎种植部位组(在妊娠包块5 mm以内的区域,去除胚胎组织,为输卵管壶腹部)和胚胎非种植部位组(为输卵管峡部);宫内妊娠组为输卵管结扎部位(为输卵管峡部)。根据 Pub Med Gene Bank 提供的GAPDH、TLR-2 基因序列,并使用 Primer-Blast进行引物设计,由上海铂尚生物合成,序列如下:TLR-2(144bp)上游:5’-GCCTCTCCAAGGAAGAATCC-3’;下游:5’-TCCTGTTGTTGGACAGGTCA-3’;GAPDH(138bp)上游:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’;下游:5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。实时定量荧光PCR:根据试剂盒说明书严格进行操作:① 提取组织总RNA并反转录合成cDNA;② 应用Cobas Z480荧光定量PCR扩增仪对TLR-2 mRNA 的相对表达量进行检测;③ 采用 2-ΔΔct法计算各组目的基因表达水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0处理数据,计量资料以M(P25,P75)表示,组间比较采用Mann-Whitney U秩和检验,多组间比较采用Kruskal-Wallish H秩和检验,P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组年龄、妊娠次数、体质量指数(body mass index,BMI)比较,差异均无统计学意义(P>0.05),详见表 1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组TLR-2 mRNA和TNF-α表达情况比较

输卵管妊娠组(胚胎种植部位与非种植部位合为输卵管妊娠组)TLR-2 mRNA的表达水平及TNF-α的浓度均高于宫内妊娠组,差异有统计学意义(P<0.05),详见表2。

2.3 TLR-2 mRNA在不同输卵管组织中的表达情况比较

将输卵管组织分为宫内妊娠组、输卵管妊娠胚胎种植部位组、输卵管妊娠胚胎非种植部位组,各30例样本。输卵管妊娠胚胎种植部位组的TLR-2 mRNA表达最低,输卵管妊娠非种植部位表达最高,其中两两比较结果详见表3。

表3 TLR-2mRNA在不同输卵管组织中的表达情况比较

3 讨论

TLR-2主要表达在上生殖道(子宫内膜和输卵管),而下生殖道却很少发现(宫颈外口和阴道),这种表达模式利于最大程度地降低对富有寄生菌的下生殖道的免疫反应,同时又能有效识别侵入上生殖道的病原体,从而起到有效的免疫防御作用[4]。当病原体入侵感染输卵管,输卵管TLR-2的表达增强,TLR-2通过膜式识别受体对其相应的病原体相关分子进行识别、结合,TIR结构域(Toll/IL-1 receptor homologue region)向胞内传递信号,启动核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)转录因子,诱导IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α等多种炎症细胞因子表达,启动免疫反应参与抗感染[5]。生理水平的TNF-α可以平衡滋养细胞的生长发育,在胚胎正常发育过程中不可或缺;通过影响细胞凋亡来维持胎盘组织细胞稳态;高于生理含量的TNF-α则可能刺激一些有害物质的生成,干扰孕卵游走,使其着床于管壁,导致输卵管妊娠[6]。

本研究中,与宫内妊娠组相比,输卵管妊娠组的血清TNF-α浓度更高。TLR-2 mRNA在输卵管妊娠胚胎种植部位中表达最低,宫内妊娠组次之,输卵管妊娠非种植部位最高;这种结果可能是受病原体感染的输卵管产生免疫损伤所致。Huggins等[7]通过实验证实当微生物暴露后,TLR通过炎症信号将T细胞募集到感染部位,增强了适应性免疫反应;但免疫反应是一把“双刃剑”,免疫反应过度会导致免疫损伤。张红霞等[8]发现TLR-2蛋白在轻度病变的输卵管黏膜中表达增高,而在积水的输卵管中的表达下降;可能处于初次感染的阶段时,输卵管TLR-2蛋白的表达上调,它通过启动相关通路激发各种免疫细胞分泌炎症因子来参与病原体清除,保持输卵管黏膜上皮的完整性,从而使输卵管正常或仅为黏膜炎症;但当TLR-2介导的局部炎症反应过强,则诱发组织损伤,受损后输卵管上皮的TLR-2蛋白表达减少。推测TLR-2 mRNA在宫内妊娠组中是妊娠状态下的基础表达,而在输卵管妊娠组的胚胎种植部位为免疫过度反应导致了低表达,非种植部位是免疫反应后的高表达。

且TLR-2 mRNA在输卵管胚胎种植部位中表达最低,非种植部位的表达最高,可能存在可溶性TLR-2蛋白的免疫负反馈作用。研究发现在胚胎种植部位的输卵管管腔中发现可溶形式的颗粒状TLR-2蛋白,其对输卵管黏膜上的TLR-2 mRNA表达有负反馈作用,抑制了黏膜上TLR-2 mRNA的表达[2]。可溶形式的TLR-2蛋白在感染和炎性疾病期间浓度会增加,并从组织和血细胞释放到循环系统中[9],它可通过隔离病原体来降低免疫激活[10]。

目前多数输卵管TLR-2表达情况的研究是在输卵管妊娠与因良性疾病切除的输卵管比较[2],或是炎症感染的输卵管与正常输卵管组织相比[3,8,11],没有同在妊娠状态或输卵管不同部位TLR-2表达的报道。而本研究通过检测宫内足月妊娠的输卵管峡部及输卵管壶腹部妊娠的输卵管峡部、壶腹部的TLR-2 mRNA的表达情况,发现输卵管TLR-2 mRNA、外周血血清TNF-α与输卵管妊娠相关。本研究样本量较少,且早孕与晚孕激素水平的不同也可能影响输卵管TLR-2 mRNA的表达,将来应通过扩大样本量及加做免疫组化实验等进一步探究TLR-2与输卵管妊娠的关系。有学者指出TLR-2介导的炎症信号传导和超敏反应的特异性阻断策略可能会提供新颖的治疗策略来预防多种疾病[12],将来通过对输卵管妊娠患者血清中TNF-α及可溶形式的TLR-2蛋白或输卵管组织中的TLR-2蛋白表达等的进一步深入研究,有望助力于输卵管妊娠的早期诊断及临床治疗。