基于内质网应激PERK/eIF2α信号通路探讨温针灸足三里联合香砂六君子汤治疗脾胃气虚型功能性消化不良的作用

屈学斌，廖文力，卢允健，黎灿文，李霭燕

（1.广州市番禺区中医院，广东 广州 511400 ；2.广州市番禺区第五人民医院，广东 广州 511495）

功能性消化不良是临床上常见的消化系统疾病之一。此病的发病率较高。据统计，在世界范围内，功能性消化不良的发病率达到了20.8%[1]。虽然功能性消化不良不会严重威胁患者的生命，但它会严重影响患者的生活质量[2]。有研究指出，功能性消化不良的病机主要是脾虚气滞，中医认为气机失调与胃肠动力紊乱密切相关，而健脾理气对增强胃动力有显著作用[3]。香砂六君子汤是健脾理气方中最有代表性的一种药方。大量临床观察证实，香砂六君子汤治疗功能性消化不良在缓解症状和降低复发率方面具有一定优势[4-5]。丁伯龙[6]的研究显示，香砂六君子汤可通过调控内质网应激信号通路 PERK/eIF2α 来改善胃肠运动障碍，治疗脾气虚证。非药物治疗功能性消化不良，如艾灸治疗功能性消化不良的疗效显著，应用前景广阔，显示了中医治疗的独特优势[7]。温和的艾灸既能促进胃的运动，调节胃肠蠕动，又能改变神经细胞的可塑性，调节相关蛋白和细胞因子的表达；其起效机制较为复杂。相关研究表明，艾灸足三里在治疗功能性消化不良方面的临床疗效和安全性优于西医疗法，且在改善患者生活质量方面具有独特的优势[8]。吴阳阳等[9]发现，针灸“曲池”和“足三里”可以通过抑制氧化应激和内质网应激来缓解肠道疾病。已有大量研究显示，持续的内质网应激可通过P-EIF2α诱导ATF4 的翻译过程，而ATF4 可导致促凋亡基因CHOP 表达的升高，从而促使细胞死亡[10]。由此可见，PERK/EIF2α 是细胞凋亡或由内质网应激产生自噬的共同途径[11]。因此，推测香砂六君子汤联合温针灸足三里治疗功能性消化不良的作用机制可能与内质网应激PERK/eIF2α 通路的调控有关。本研究以内质网应激的PERK-eIF2α 信号路径为切入点，以大鼠为模型，对大鼠脾胃气虚型功能性消化不良的调节机制和治疗作用进行了研究。

1 实验材料及主要试剂、耗材

1.1 大鼠模型建立及分组

选取SPF 级SD 大鼠60 只，在进行实验前，给予3 d 适应性饲养，然后用随机数表法分为正常组、模型组、西药组、中药组、温针灸组、联合组，每组10只。分别用苦味酸在各组实验大鼠的皮毛上进行标识。除了正常组实验鼠外，其余5 组实验鼠根据改进的夹尾刺激法+不规则喂养+冷生理盐水灌胃法建立功能性消化不良大鼠模型，即将同组实验鼠放入同一笼中，用医用纱布将长柄金属钳端部进行3 ～4 层紧密包裹，将包裹部分钳夹在实验鼠尾部后1/3 段，强度以刺激实验鼠发出尖叫声或打斗为宜，每次刺激30 min，每日早晚各1 次；用冷生理盐水（2 mL）灌胃，每次早晚各1 次；同时，建模期间单日禁食，并在双日内正常喂食。功能性消化不良大鼠建模成功的标准：实验大鼠毛发干枯发黄、大便溏泄、进食量和体重明显下降，情绪状态由开始时的烦躁不安转变为精神不振、活动度减弱，随机抽取1 只大鼠进行解剖，未发现其肠胃组织出现器质性病变。具体分组：正常组：10 只SPF级SD 鼠；模型组：10 只功能性消化不良大鼠；西药组：10 只用多潘立酮药液进行灌胃治疗的功能性消化不良大鼠；中药组：10 只用香砂六君子汤药液进行灌胃治疗的功能性消化不良大鼠；温针灸组：10 只采用温针灸疗法进行治疗的功能性消化不良大鼠；联合组：10只联合应用温针灸+ 香砂六君子汤灌胃疗法进行治疗的功能性消化不良大鼠。温针灸组的治疗方法是：将大鼠的四肢固定在手术台木板上，用电推刀剔除其下肢后关节外侧（腓骨小头前下方5 mm 处足三里穴区2 cm×2 cm 的位置）的鼠毛。剃净后，先用华佗牌毫针直刺足三里穴，深度约为5 mm，以实验大鼠能够耐受为度，然后用特制的香烟型艾条在距离足三里穴2.0 cm 处进行悬灸，每次温针灸15 min，每日一次，连续治疗28 d。联合组的治疗方法是：使用香砂六君子汤（1.5 mL）进行灌胃，每日早晚各一次；温针灸干预每日早上开展一次，连续治疗28 d。

1.2 主要试剂

于武汉博士德生物工程有限公司采购多聚甲醛溶液；二甲苯、石蜡、苏木素、伊红、中性树胶等购于上海国药集团化学试剂有限公司；一抗（PERK 单克隆一抗、p-eIF2α 单克隆一抗）、二抗和SDS-PAGE电泳液等购于碧云天生物技术研究所。

2 实验方法

2.1 测量大鼠的体重、胃排空率

在开始建模当日、建模第7 天、建模成功当日以及干预首日、第7 天、第14 天、第21 天、第28 天的早上7 点用电子秤称量大鼠的体重。在末次灌胃干预后，实验大鼠均禁食12 h（无需禁水），然后每只灌胃2 mL 的半固体米糊（将16 g 奶粉、8 g 淀粉、8 g 糖、10 g 羧甲基纤维素钠、2 g 活性炭、250 mL蒸馏水混合均匀，配制为黑色半固体糊状物，1 g/mL，放入冰箱冷藏，使用时先恢复室温）。灌胃30 min 后，使用剂量为0.2 ～0.3 mL/100 g 的10%水合氯醛进行腹腔麻醉。麻醉起效后，将实验大鼠固定在操作台上，用酒精对腹部进行消毒，沿腹部正中线剖腹。找到胃部后，用缝合线结扎幽门、贲门，间断结扎线外侧。将胃部摘取下来。利用断头法处死大鼠，用电子天秤称量全胃重。将胃体剪开后，检测胃内容物；并用冷生理盐水冲洗干净，用滤纸擦干，观察胃黏膜的表面有无潮红、肿胀、溃疡、糜烂等病理变化，并用电子秤称量空胃重量。

2.2 大鼠胃窦组织组织形态的检测方法

胃窦组织HE 染色：（1）固定：用眼科剪剪取实验大鼠幽门上部的胃窦组织，置于含有4%多聚甲醛溶液的刻度管中固定24 h。（2）石蜡包埋：固定好胃窦组织后，进行酒精梯度脱水，依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中透明处理10 min。将其浸泡于已加热溶解的液体石蜡中，并于60℃恒温箱中浸蜡2 h。用石蜡包埋机包埋胃窦组织。（3）切片：将包埋的石蜡块切成4 μm 石蜡切片，在温水中展平，然后将其转移到载玻片上，烤干待用。（4）染色：对切片进行脱蜡、酒精水化处理，然后将载玻片浸泡到苏木素中染色5 min，洗涤后再放入0.5%伊红溶液中复染2 min，用自来水冲洗后再进行脱水、烘干。在载玻片表面滴加中性树胶，加盖玻片，用光学显微镜观察胃窦组织黏膜、腺体、肌层、黏膜层等的变化情况。

2.3 免疫组化检测胃窦组织PERK、p-eIF2α 表达情况

具体方法：（1）抗原修复：切片行常规脱蜡水化，加入柠檬酸缓冲液中浸泡并加热修复5 min。（2）封闭：在切片上滴加3% 过氧化氢溶液，避光10 min，再滴加山羊血清封闭，在室温下孵育10 min。（3）滴加抗体：滴加一抗（PERK 单克隆一抗、p-eIF2α 单克隆一抗），然后滴加二抗，在37℃室温环境中孵育15 min。（4）显色复染：在切片上滴加100 μL 显色剂显色3 ～5 min 后用蒸馏水冲洗，并置于陈旧苏木精溶液中浸泡1 min 复染，最后按照酒精梯度法对切片进行脱水，用中性树胶封片。

2.4 Westernblot 检测胃窦组织PERK、p-eIF2α、elF2α 蛋白相对表达量

具体步骤：（1）提取胃窦组织总蛋白：取适量胃窦组织，称取其重量。按照1 mg 胃窦组织添加10 μL RIPA 裂解液的比例在EP 管中加入胃窦组织和裂解液，再添加PMSF（RIPA 裂解液:PMSF=100:1）。用组织剪剪碎胃窦组织，并用超声波细胞破碎仪打碎组织，随后将组织放在冰上裂解30 min，并进行低温离心处理，吸取上清液，即得胃窦组织总蛋白标本。（2）检测浓度：应用 Nanodrop 2000 分光光度计测量胃窦组织总蛋白质的浓度及其液体量。（3）SDS-PAGE 电泳：应用8% SDS-PAGE 分离胶配制PERK 分离胶，应 用12% 分 离 胶 配 制 p-eIF2α、elF2α、Tubulin分离胶，匀速缓慢注入玻璃板间隙中。然后制作 5%PERK、p-eIF2α、elF2α、Tubulin 浓缩胶，于分离胶上方的玻璃板间隙缓慢注入浓缩胶。最后上样进行电泳操作。（4）转膜：应用湿转法对 PERK 蛋白进行转膜，应用半干转法对 p-eIF2α、elF2α、Tubulin蛋白进行转膜。（5）封闭和杂交：取出 PVDF 膜，将其浸泡到5%脱脂奶粉封闭液中，常温封闭1 h。然后，加入相应的一抗工作液（PERK、p-eIF2α、elF2α为目的蛋白，Tubulin 为内参蛋白），4℃孵育24 h。经 TBST 冲洗后，加入二抗，室温孵育 2 h，用 TBST洗涤。（6）检测：应用 Odyssey 扫膜仪扫膜，通过Odyssey 软件进行定量分析，检测条带的灰度值。

3 实验结果

3.1 实验大鼠体重

在实验第14 天、实验第28 天，与正常组相比，模型组的体重均较小，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，西药组、中药组、温针灸组和联合组的体重均较大，差异有统计学意义（P＜0.05）；与中药组、温针灸组相比，西药组、联合组的体重均较大，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 大鼠实验不同天数的体重变化

3.2 实验大鼠的胃排空率

根据下述公式计算胃排空率；胃排空率=[1-（全胃重- 空胃重）/ 所灌米糊重量]×100%。与正常组相比，模型组的胃排空率较低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，西药组、中药组、温针灸组和联合组的胃排空率均较高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与西药组、中药组、温针灸组相比，联合组的胃排空率较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 实验大鼠的胃排空率（%，± s）

表1 实验大鼠的胃排空率（%，± s）

分组 胃排空率 显著性正常组 61.71±5.95模型组 40.02±7 01 与正常组比, P=0.004西药组 55.18±6.90 与模型组比, P=0.021中药组 53.33±4.25 与模型组比, P=0.018温针灸组 56.25±9.51 与模型组比, P=0.011联合组 63.86±4.67 与模型组比, P=0.003

3.3 胃窦组织形态学比较

由图2 可以看出，正常组和联合组的腺体排列规则，存在少量嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及淋巴细胞；模型组可观察到：少量嗜酸性粒细胞、大量淋巴细胞及中性粒细胞，腺体呈现不规则排列，其余则无明显异常；西药组、中药组和温针灸组可以观察到：腺体排列尚规则，可见少量淋巴细胞、中性粒细胞，以及个别嗜酸性粒细胞，炎性细胞浸润较模型组减轻。

图2 组织病理学染色图（×200）

3.4 免疫组化检测胃窦组织PERK、p-eIF2α 表达情况

通过免疫组化检测胃窦组织 PERK、p-eIF2α 表达情况，如图3 和图4 所示：与正常组比较，模型组大鼠胃窦组织的PERK、p-eIF2α 着色显著降低；与模型组相比，西药组、中药组、温针灸组、联合组均表现为PERK、p-eIF2α 着色显著增多。

图3 免疫组化检测胃窦组织 PERK 表达情况

图4 免疫组化检测胃窦组织 p-eIF2α 表达情况

3.5 Westernblot 检测胃窦组织PERK、p-eIF2α、elF2α 蛋白相对表达量

由图5 和图6 可知，与正常组比较，模型组大鼠胃窦组织的PERK、p-eIF2α 蛋白表达显著降低，eIF2α 蛋白表达升高；与模型组相比，西药组、中药组、温针灸组、联合组均表现为 PERK、p-eIF2α 蛋白表达显著升高，eIF2α 蛋白表达降低，差异均具有统计学意义（* 表示P＜0.05 ；** 表示P＜0.001）。

图5 Western blot 检测大鼠胃窦组织PERK、p-eIF2α、elF2α蛋白相对表达量

图6 Western blot 检测大鼠胃窦组织PERK、p-eIF2α 蛋白相对表达量

4 结论

本研究发现温针灸足三里+ 香砂六君子汤可以有效治疗脾胃气虚型功能性消化不良可能与其调节内质网应激PERK-eIF2α-ATF4 信号通路的作用有关。p-eIF2α 可诱发ATF4 的翻译过程，促凋亡基因CHOP 通过ATF4 可上调其表达水平，进而可导致细胞死亡。上述研究结论为针药治疗功能性消化不良提供了坚实的理论基础。