基于网络药理学探讨丹参治疗重症哮喘的作用机制

邓安妮，陈 玉，李沁瑶，胥崟崧

( 成都中医药大学，四川 成都 610075)

支气管哮喘是儿童期最常见的慢性呼吸道疾病，临床主要表现为反复发作的喘息、胸闷、咳嗽或呼气性呼吸困难，目前发病原因尚未完全清楚。哮喘迁延不愈可引起气道重塑、肺功能损伤等，而其重症急性发作可迅速发展为呼吸衰竭甚至危及生命。据报道，儿童哮喘的发病率可能高达5%[1-2]。重症哮喘的患病率在成人随机样本中为1.1%，在哮喘人群样本中的占比为9.5%。与其他哮喘患者相比，重症哮喘患者有更多的症状、更严重的活动受限、心脏病和更高的血液中性粒细胞水平，且其肺功能也较差[3]。虽然重症哮喘所占比例不大，但给患者带来了巨大的身体、精神、情感和经济负担。近年来，大量研究发现中药的某些化学成分在重症哮喘的防治上疗效显著。提示中医药多靶点、多环节的整体调节作用在对本病进行防治方面具有潜在优势。丹参始载于《神农本草经》，善于活血祛瘀，且祛瘀而不伤正。其活血化瘀通血脉之力较强，可将深伏于肺络之瘀血驱逐于外。中性粒细胞型哮喘是重症哮喘的一个重要表型。谢欣辛等[4]的研究表明，丹参可通过抑制补体系统的激活来减轻中性粒细胞型哮喘小鼠体内的炎症。研究证明，丹参可改善微循环，提高耐缺氧能力，且具有一定的镇静、镇痛、抗炎作用[5]。本文将利用网络药理学对丹参治疗重症哮喘的分子机制进行研究。

1 材料与方法

1.1 筛选丹参的潜在靶点

在TCMSP 数据库中检索丹参，通过口服生物利用度＞30% 且类药性＞0.18 筛选成分。丹参成分靶点信息通过 TCMSP 和Swiss Target Prediction 数据库共同确定，最后通过Uniprot 数据库规范靶点信息。

1.2 筛选重症哮喘的靶点

分别在GeneCards、Drugbank 和TTD 数据库中输入“severe asthma”，检索重症哮喘相关靶点，通过中位数评分筛选靶点。

1.3 共同靶点PPI 网络

将丹参对应靶点和重症哮喘的靶点取交集。将交集靶点导入 String 平台，得到TSV 文件。将PPI TSV文件导入CytoScape 3.9.0，分析其拓扑学参数并以此筛选关键靶点。

1.4 富集分析

利用Metascape 数据库将丹参对重症哮喘的潜在作用靶点进行KEGG 分析。

1.5 建立中药-成分-靶标网络

利用Cytoscape 3.9.0 构建中药- 成分- 靶标网络。连接度、介度和紧密度等拓扑参数是评价丹参调治重症哮喘核心活性成分、核心靶点的主要参考指标。

2 结果

2.1 丹参中的有效成分及其靶点

检 索TCMSP 数 据 库，利 用OB 和DL 共 筛 选得 到65 种 有 效 成 分。利 用TCMSP 和Swiss Target Prediction 数据库预测靶点，在去除重复值后，共得到与有效成分相关的潜在作用靶点680 个。

2.2 重症哮喘的靶点

在Genecards 中通过中位数评分筛选靶点。同时纳入TTD 和Drugbank 获得的靶点，剔除重复靶点，最终获得重症哮喘的靶点693 个。

2.3 构建PPI 网络

丹参作用于重症哮喘的共同靶点有165 个，见图1。将共同靶点导入String 平台，将生物种类设定为“Homo sapiens”，其余均为默认设置，得到PPI 网络，见图2。利用拓扑分析筛选出12 个关键靶基因，详细信息见图3。

图1 丹参与重症哮喘重合的靶点韦恩图

图2 丹参作用的165 个共同靶点网络关系图

图3 关键靶点网络节点特征参数

2.4 功能与通路的富集分析

将165 个共同靶点上传至Metascape 数据库进行KEGG 富集分析，分析提示参与丹参调治重症哮喘的主要通路有：PI3K-Akt 信号通路、钙信号通路、Th17细胞分化信号通路、HIF-1 信号通路、MAPK 信号通路，见图4。

图4 丹参KEGG 通路富集分析气泡图

2.5 构建中药-活性化学成分-交集靶点网络

利用 Excel 将丹参作用于重症哮喘的活性化学成分、靶点建立网络和属性文件，然后导入Cytoscape 3.9.0 软件。方形代表基因靶点，三角形代表丹参的有效活性化学成分，见图5。以内置工具Network Analyzer 得到的参数作为评价指标，筛选出最重要的活性化学成分和靶点，见图5、图6。

图5 丹参治疗重症哮喘的“中药-活性化学成分-交集靶点”网络

图6 丹参“中药-活性化学成分-交集靶点”网络中核心成分及核心靶点特征参数

3 讨论

哮喘属“哮病”范畴, 重症哮喘较普通哮喘病情重，其预后差、易反复发作，且对激素治疗不敏感，多被现代医家归属于“虚哮”“顽哮”范畴。重症哮喘病因复杂, 病机多变，多虚实夹杂，现代医家认为其病因病机多与“感受外邪”“气闭”“痰阻”“血瘀”“脏腑亏虚”等密切相关[6-7]。“血瘀”是重症哮喘发生发展的重要影响因素，丹参为常用的活血化瘀药，也是从瘀论治哮喘时的常用药。有研究表明，丹参可通过抑制TGF-β1以及MMP-9 的表达来改善哮喘气道重塑[8]。

本研究得到165 个共同靶点以及对应的62 种活性成分。其中木犀草素、2- 异丙基-8- 甲基菲-3,4-二酮、紫丹参素C、丹参醇A、丹参新醌D 等活性成分的作用较强。推测上述有效成分可能是丹参调治重症哮喘的重要物质基础。木犀草素是一种黄酮类化合物[9]，能够减轻哮喘幼鼠的气道炎症, 其可能是通过抑制诱导型一氧化氮合酶/ 一氧化氮信号途径来发挥作用[10]。余洁等[11]的研究表明，木犀草素可抑制哮喘患儿体内促炎性细胞因子TNF-α、IL-6 的分泌,并通过TLR4/NF-κB 信号通路发挥抗炎作用。气道重塑是重症哮喘的病理学基础。实验研究证明，丹参醇A（DA）能够减轻心脏重塑，改善心脏损伤和心肌胶原体积[12]。ICAM-1 和VEGF 与炎症细胞因子及哮喘严重程度密切相关[13]。虽然关于丹参核心化学成分治疗重症哮喘的直接研究较少，但其抗炎、抗血栓形成等作用功效仍被认为可作为治疗重症哮喘的有效途径。本文通过对丹参治疗重症哮喘共同靶点网络的构建，得到PTGS2、AR、ESR1、OPRM1、ADRB2 5 个核心靶点。COX-2（PTGS2）蛋白的升高是以失调炎症为代表的呼吸系统疾病病理生物学改变的关键影响因素[14]。有研究指出，木犀草素能够减轻哮喘幼鼠的气道炎症与其抗氧化应激和抑制COX-2 信号通路作用密切相关[15]。研究表明，较高的支气管 AR 表达和较高的雄激素水平有利于哮喘患者肺功能的改善[16]。雌激素主要通过雌激素受体（ER）ERα 和ERβ 发挥作用，而ERβ 在气道重塑中发挥着重要作用，其可作为治疗重症哮喘的潜在靶标[17-18]。有研究指出，β2- 受体激动剂可抑制气道平滑肌增殖及气道壁的增厚, 从而干预气道重塑[19]。研究表明，阻断PI3KAkt 信号通路可延缓气道重塑进程[20]。MAPK 信号通路在哮喘发病进程中可介导免疫／炎症细胞反应以及气道结构细胞反应[21]。T 辅助17（Th17）细胞在重症哮喘的发病机制中起到重要作用。Yes 相关蛋白(YAP)/ 缺氧诱导因子-1α (HIF-1 α)/microRNA-182(miR-182)/早期生长反应 2 (EGR2) 轴可参与介导哮喘中的 Th17 细胞分化，影响哮喘的严重程度[22]。有研究[23]表明，抑制IL-17/NF-κB/MAPK 通路可以缓解OVA诱导的小鼠哮喘模型气道高反应性和气道炎症。

综上所述，本研究通过网络药理学方法初步阐释了丹参对重症哮喘的作用是通过木犀草素、丹参醇A、紫丹参素C 等活性成分作用于PTGS2、AR、ESR1、ADRB2 等核心靶点，并通过PI3K-Akt 信号通路、Th17细胞分化信号通路、HIF-1 信号通路等与炎症、免疫等密切相关的通路来实现的，这为临床合理运用丹参和相关新药的开发提供了科学依据。但本研究未考虑中药成分的剂量以及煎煮后的化学成分和活性成分在体内的代谢物等因素，故后续仍需在此基础上进行相关动物或细胞实验验证。