糖代谢异常患者外周血Treg和Th17细胞的变化

沈 艳，李文花，龙密密，谭玉洁

（1.六盘水市人民医院检验科，贵州 六盘水 553000；2.贵州医科大学附属医院临床检验中心，贵州 贵阳 550004）

糖代谢异常（GM）是机体葡萄糖代谢出现异常的一类疾病，包括糖尿病（DM）前期和DM。DM 的发生与遗传、环境及自身免疫等多种因素有关，但其具体病因目前尚未明确。近年来的研究表明，DM 是以高血糖为主要特征的低度炎症性疾病[1]，而炎症的发生与机体免疫状态密切相关，已有文献报道DM 的发生与免疫功能紊乱有关[2-3]。Th17 细胞是一种不同于Th1、Th2 的新型CD4+T 细胞，在各种传染性疾病、癌症和许多自身免疫性疾病的发生发展中起着重要作用。Treg 细胞是一种具有免疫调节功能的免疫抑制性T 细胞，与多种免疫性疾病的发病机制或免疫状态密切相关，在维持机体免疫稳态和调控免疫应答方面发挥着重要作用。Treg 细胞分泌的转化生长因子-β（TGF-β）细胞因子可促进Th17 细胞的分化，提示Th17 细胞与Treg 细胞的分化存在密切的联系。Th17细胞与Treg 细胞之间处于动态平衡状态，若这种平衡状态被打破则易发生炎症及自身免疫性疾病。目前，DM 中关于Treg 细胞的研究尚存在争议。本研究拟通过观察GM 患者外周血Th17 细胞和Treg 细胞数量的变化，探讨GM 时机体免疫功能及其平衡调节的变化情况，明晰相关免疫细胞在GM 发生发展中的作用，以期为GM 的发生机制及治疗策略研究提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取贵州医科大学附属医院门诊及住院部的GM患者78 例为研究对象，其中男45 例，女33 例，年龄11 ～75 岁，平均年龄（47.53±15.68）岁。在这些患者中，有T1DM 患者18 例，DM 前期患者20 例，T2DM 初诊患者20 例，T2DM 伴并发症患者20 例。GM 分类符合1999 年世界卫生组织（WHO）糖尿病专家委员会提出的相关标准。对照组为我院同期健康体检者20 例，其中男8 例，女12 例，年龄28 ～79 岁，平均年龄（46.15±13.44）岁。健康体检者与GM 患者的性别及年龄相比，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 仪器与试剂

CD4-FITC、CD25-PE-Cy™7、IL-17A-PE、A-Fluor 647-CD127（均为鼠抗人），同型对照FITC Mouse IgG1，κ Isotype Control RUO、Alexa Fluor®647 Mouse IgG1 κ Isotype Control RUO、PE Mouse IgG1，κ Isotype Control RUO、PE-Cy ™7 Mouse IgG1 κ Isotype Control RUO，刺激剂+ 蛋白转运抑制剂，均为美国BD 公司生产。FACS Canto Ⅱ流式细胞仪由BD 公司制造。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 所有研究对象均隔夜禁食8 ～12 h，采集清晨空腹静脉血2 mL，置于EDTA-K2 真空抗凝采血管内，混匀后于室温下保存，用于检测Treg 细胞和Th17 细胞的表达。

1.3.2 Treg 细 胞 检 测 取CD4-FITC、A-Fluor 647-CD127 各5 μL、CD25-PE-Cy™7 1.25 μL，加 入50 μL EDTA-K2 抗凝血，震荡混匀后于室温下避光孵育30 min。加入溶血素1 mL，震荡混匀后于室温下溶血5 min，然后再置于37 ℃恒温水浴箱中溶

血5 min。待血融透后，加入3 mL PBS，震荡混匀后用低速离心机以1500 r/min 的转速离心5 min，洗涤两次，加入0.3 mL PBS 重悬细胞，混匀后上机检测。收集20 000 个淋巴细胞，采用Flowj0 7.6 软件分析CD4+CD25+CD127low 细胞占CD4+T 细胞的百分比（Treg/CD4+T%）。

1.3.3 Th17 细胞检测 用人淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMC），加入PBS 至1 mL，重悬细胞，混匀备用。取24 孔细胞培养板，每孔加入1 mL含10%FBS 的1640 培养基，然后加入上述制备好的细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/mL，用移液枪吹打混匀，再加入2 μL 刺激剂+蛋白转运抑制剂，吹打混匀，置于37 ℃、5%的CO2培养箱中培养刺激6 ～8 h。加入PBS，以1500 r/min 的转速离心5 min，洗涤两次，加入10 μL 的CD4-FITC，4 ℃下避光孵育30 min。加入PBS，以1500 r/min 的转速离心5 min，洗涤2次，加入固定/ 破膜洗液1 mL，颠倒混匀，4 ℃下避光孵育1 h。加入固定/ 破膜洗液1 mL，以1500 r/min的转速离心5 min，洗涤2 次；加入10 μL IL-17APE，4 ℃下避光孵育50 min。加入固定/破膜洗液1 mL，以1500 r/min 的转速离心5 min，洗涤2 次，加入300 μL的PBS 重悬细胞，上机检测。每管收集20 000 个淋巴细胞，采用Flowj0 7.6 软件分析CD4+IL-17A+细胞占CD4+T 细胞的百分比（Th17/CD4+T%）。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 GM 组外周血Treg、Th17 细胞及Treg/Th17的对比

与NC 组比较，GM 组的Treg/Th17 降低，Treg和Th17 细胞均升高（P＜0.05）。详见表1。

表1 GM 组外周血Treg、Th17 细胞及Treg/Th17 的对比（± s）

表1 GM 组外周血Treg、Th17 细胞及Treg/Th17 的对比（± s）

注：**与NC 组比较，P ＜0.01。

组别 Treg 细胞（%）Th17 细胞（%）Treg/Th17 GM 组（n=78）4.67±1.04** 1.49±0.38** 3.28±0.96**NC 组（n=20）3.62±0.64 0.83±0.19 4.54±1.19

2.2 不同病程GM 患者外周血Treg、Th17 细胞及Treg/Th17 的对比

与NC 组比较，不同病程（DM 前期、T2DM 初诊、T2DM 伴并发症）GM 组的Treg 和Th17 细胞均升高（除DM 前期组的Treg 细胞），Treg/Th17 均降低（P＜0.05），且随着病程进展，Treg 和Th17 细胞逐渐增加，Treg/Th17 逐渐降低，其中以T2DM 伴并发症组最为明显。详见表2。

表2 不同病程GM 患者外周血Treg、Th17 细胞及Treg/Th17的对比（± s）

表2 不同病程GM 患者外周血Treg、Th17 细胞及Treg/Th17的对比（± s）

注：**组间比较，P ＜0.01；a 与NC 组比较，P ＜0.05；b 与DM 前期组比较，P ＜0.05 ；c 与T2DM 初诊组比较，P ＜0.05。

组别 Treg 细胞（%）Th17 细胞（%）Treg/Th17 DM 前期（n=20）4.10±0.79 1.14±0.17a 3.69±0.92a T2DM 初诊（n=20）4.38±0.75a 1.41±0.22ab 3.22±0.94a T2DM 伴并发症（n=20）5.21±1.30abc 1.78±0.23abc 2.96±0.78ab NC 组F 值P 值4.54±1.19 10.047 0.000**3.62±0.64 10.777 0.002**0.83±0.19 78.104 0.000**

2.3 不同类型GM 患者外周血Treg、Th17 细胞及Treg/Th17 的对比

与NC 组比较，T1DM 组和T2DM 组的Treg 和Th17细胞均升高，Treg/Th17 均降低（P＜0.05）。详见表3。

表3 不同类型GM 患者外周血Treg、Th17 细胞及Treg/Th17的对比（± s）

表3 不同类型GM 患者外周血Treg、Th17 细胞及Treg/Th17的对比（± s）

注：**组间比较，P ＜0.01 ；a 与NC 组比较，P ＜0.05。

组别 Treg 细胞（%）Th17 细胞（%）Treg/Th17 T1DM 组（n=18）5.04±0.85a 1.65±0.46a 3.27±1.08a T2DM 组（n=40）4.80±1.13a 1.60±0.29a 3.09±0.86a NC 组（n=20）F 值P 值3.62±0.64 12.963 0.000**0.83±0.19 45.492 0.000**4.54±1.19 14.380 0.000**

3 讨论

Treg 细胞能分泌多种具有免疫调节功能的细胞因子，抑制效应T 细胞的免疫应答，与多种免疫性疾病的发病机制或免疫状态密切相关，在维持机体免疫稳态和调控免疫应答方面具有重要作用。Th17 细胞是一种不同于Th1、Th2 的新型CD4+T 细胞，主要分泌白细胞介素-17（IL-17），受转录因子RORrt 的分化调控，在各种传染性疾病、癌症和许多自身免疫性疾病的发生发展中起着重要作用。本研究中对所有研究对象均进行外周血Treg 细胞和Th17 细胞检测，结果发现GM 组的Treg 细胞和Th17 细胞均升高，Treg/Th17 比值降低。国内外相关研究指出，Th17 细胞在DM 中表达上升，增加的Th17 细胞可分泌效应因子，调节许多致炎因子的表达，从而引起DM 患者的胰岛β 细胞损害和死亡[4]。Treg 细胞在DM 的发生发展中发挥着重要作用，DM 患者体内的Treg 细胞存在数量或功能的缺陷。据报道，Treg 细胞对机体的免疫保护机制减弱可增强慢性炎症的刺激及增加炎性因子的分泌，导致胰岛素敏感性进一步减弱，引起DM 的发生发展。研究发现，Treg 细胞在DM 的发病初期就会增加。也有研究发现，T1DM 患者体内的Treg 细胞表达高于对照组。现阶段，关于Treg 细胞的研究尚存在争议，可能与地区差异或研究人群异质性有关。本文数据显示，GM 患者的Treg 细胞和Th17 细胞均随病程进展而逐渐增加，Treg/Th17 比值逐渐降低，其中以T2DM 伴并发症者最为明显。Th17 细胞在DM 前期就开始增加，而Treg 细胞在T2DM 初诊时才开始增加。Hotamisligil 于1993 年首次在肥胖小鼠的脂肪组织中发现炎症因子与DM 的发生有关。随后的研究发现，在DM 发病前数年，患者体内就有炎症反应增强的迹象，而当DM 伴并发症时，这种炎症反应有所增强[5]。本研究中通过观察不同类型的DM 患者，我们还发现T1DM 组和T2DM 组的Treg 细胞和Th17 细胞均明显增加，提示Treg 细胞和Th17 细胞参与了T1DM 和T2DM 的发病机制。Th17 细胞通过分泌细胞因子导致炎症反应放大，引起胰岛β 细胞损害和死亡，最终导致DM 的发生[6]；Treg 细胞与效应T 细胞竞争白细胞介素-2（IL-2），造成效应T 细胞凋亡，导致机体免疫功能紊乱，诱发T1DM 等免疫性疾病[7]。Treg 细胞还可增强慢性炎症的刺激及增加炎性因子的分泌，导致胰岛素敏感性进一步减弱，诱发T2DM。有学者研究发现，T1DM 患者体内的Treg 细胞表达高于对照组。而Glisic 等[8]发现，T1DM 患儿的Treg 细胞中一些相关细胞因子低于正常对照组。可见，在病理情况下尽管机体代偿增加了Treg 细胞的数量，但此类细胞可能存在功能缺陷，并不能通过调节或分泌作用产生相应水平的细胞因子。

综上所述，GM 的发生与机体细胞免疫缺陷及体液免疫过度激活有关，主要表现为外周血Treg/Th17平衡的异常。GM 患者的Treg 细胞和Th17 细胞均随病程进展而逐渐增加，Treg/Th17 逐渐降低，其中以T2DM 伴并发症者最为明显。Th17 细胞在DM 前期就开始增加，而Treg 细胞在T2DM 初诊时才开始增加。T1DM 和T2DM 患者的Treg 细胞和Th17 细胞均明显增加，提示Treg 细胞和Th17 细胞参与了T1DM 和T2DM 的发病机制。因此，在临床工作中我们应重视T2DM 的发生与免疫机制的关系。