基于UPLC指纹图谱结合色度值的槐花炮制前后变化规律研究

黄瑶,陈巧华,方朝缵,邓怡芳,王文丽,胡懿,张志鹏

(广东一方制药有限公司,广东省中药配方颗粒企业重点实验室,广东 佛山 528244)

槐花为豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥花及花蕾,夏季采收,花开放时,称为“槐花”,花未开放时,称为“槐米”,味苦,性微寒,归肝、大肠经,具有清肝泻火,凉血止血的功效[1]。2020年版《中国药典》中收载的槐花炮制品有炒槐花和槐花炭[1]。生品槐花性寒,多用于治疗肝热目赤,头痛眩晕,炒黄后的槐花苦寒之性减弱,炒炭后的槐花则涩性增强,多用于出血证的治疗。槐花主要含有的芦丁、槲皮素等黄酮类化学成分[2]是其发挥药效的物质基础。槐花炮制过程中药效的变化通常伴随着化学成分的改变,马艳琴等[3]发现不同槐花炮制品中总黄酮提取率有明显的不同,炒制槐花最高(14.23%),其次为生品槐花(13.17%),最后是槐花炭(9.31%)。朱洪剑等[4]对比了槐花炮制前后芦丁、槲皮素以及鞣质的含量变化,发现芦丁和鞣质的含量高低顺序为:炒槐花>槐花生品>槐花炭,而槲皮素的含量高低顺序则为:槐花炭>槐花生品>炒槐花。研究发现,中药饮片炮制过程中饮片的外观色泽与内在化学成分的变化存在一定关联性[5-6]。槐花炒制后,颜色亦发生了明显的变化,槐花生品呈黄绿色,炒槐花呈深黄色,槐花炭则呈焦褐色[1]。可见,研究槐花炮制过程中整体化学成分与饮片外观颜色的变化规律对指导槐花的炮制与鉴别具有重要意义。中药指纹图谱是能够呈现中药整体化学组分的一种综合、可量化的鉴定手段,主要用于评价中药及其制剂的真实性、优良性和稳定性[7]。本研究拟建立槐花炮制前后的UPLC指纹图谱,并结合多模式识别分析方法对槐花生品、炒槐花及槐花炭化学成分进行系统的分析;采用分光测色仪采集槐花生品、炒槐花及槐花炭饮片粉末的色度值;同时分析槐花炮制过程中指纹图谱与色度值的动态变化规律,以期为槐花生品及其炮制品的鉴别以及炮制工艺研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

C21-WK2102型多功能电磁炉(美的集团有限公司);H-Class型超高效液相色谱仪(美国沃特世公司);MilliQDirect型超纯水系统(德国默克公司);ME204E型万分之一天平、XP26型百万分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司);KQ-700DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);111B型二两装高速中药粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司);TS7700型分光测色仪(深圳市三恩时科技有限公司)。

1.2 试剂与药材

5-羟甲基糠醛(批号:111626-202215,纯度为98.7%)、原儿茶酸(批号:110809-201906,纯度为97.7%)、芦丁(批号:100080-202012,纯度为92.2%)、异槲皮苷(批号:111809-201804,纯度为97.2%)、水仙苷(批号:111997-201501,纯度为93.1%)、槲皮素(批号:100081-201610,纯度为99.1%)、山柰素(批号:110861-202013,纯度为93.2%)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(批号:112007-202103,纯度为100%)均购自中国食品药品检定研究院;色谱级乙腈(德国默克公司);色谱级磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司);其余试剂均为分析纯,水为超纯水。

16批槐花药材(编号H1～H16)经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定,均为豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥花。16批炒槐花饮片(编号C1～C16)和16批槐花炭饮片(编号T1～T16)均为广东一方制药有限公司技术中心实验室自制。槐花来源具体信息见表1。

表1 16批槐花生品来源信息

2 方法与结果

2.1 炒槐花、槐花炭饮片的制备

炒槐花:分别取编号H1～H16的槐花生品药材,按2020年版《中国药典》通则0213清炒法炒至表面深黄色,得编号为C1～C16的炒槐花饮片。

槐花炭:分别取编号H1～H16的槐花生品药材,按2020年版《中国药典》通则0213炒炭法炒至表面焦褐色,得编号为T1～T16的槐花炭饮片。

2.2 色谱条件

采用Agilent ZORBA XRRHD StableBond C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)为色谱柱;以乙腈为流动相A,以0.1%的磷酸水溶液为流动相B,梯度洗脱(0～5 min,12%～18%A;5～9 min,18%～19%A;9～21 min,19%～35%A;21～22 min,35%～90%A;22～23 min,90%～12%A;23～30 min,12%A);柱温:40 ℃;流速:0.20 mL·min-1;检测波长:257 nm;进样量:1 μL。

2.3 对照品溶液的制备

分别取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、槲皮素、山柰素对照品适量,精密称定,加甲醇溶解,制成质量浓度分别为25.68、36.11、62.75、25.08、25.40、28.77、36.47、31.32 μg·mL-1的混合对照品溶液,即得。

2.4 供试品溶液的制备

取样品粉末(过2号筛)约0.1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,密塞,称定质量,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30 min,放至室温,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,用0.22 μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 精密称取编号H16的样品粉末1份,按“2.4”项下方法制备供试品溶液,按“2.2”项下色谱条件连续进样测定6次,以8号峰(芦丁)为参照峰S,计算各共有峰相对保留时间RSD值为0.02%～0.24%,相对峰面积的RSD值为0.14%～2.74%,说明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 精密称取编号H16的样品粉末6份,按“2.4”项下方法制备供试品溶液,按“2.2”项下色谱条件进样测定,以8号峰(芦丁)为参照峰S,计算各共有峰相对保留时间RSD值为0.04%～0.26%,相对峰面积的RSD值为0.75%～2.54%,说明该方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 精密称取编号H16的样品粉末1份,按“2.4”项下方法制备供试品溶液,按“2.2”项下色谱条件,分别于0、2、4、8、12、16、24 h进样测定,以8号峰(芦丁)为参照峰S,计算各共有峰相对保留时间RSD值为0.04%～0.90%,相对峰面积的RSD值为0.43%～2.77%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 UPLC指纹图谱研究

2.6.1 UPLC指纹图谱的生成 取16批槐花生品、炒槐花及槐花炭样品粉末,按“2.4”项下方法制备供试品溶液,“2.2”项下色谱条件进样测定,采集色谱图,将所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》分析软件,分别以编号H1的槐花生品、编号C1的炒槐花、编号T1的槐花炭色谱图为参照图谱,时间窗宽度设为0.1 min,通过多点校正对16批槐花生品、炒槐花及槐花炭的色谱图进行全谱峰匹配,对照图谱生成方法选择中位数法,生成槐花生品、炒槐花及槐花炭的对照图谱。16批槐花生品、炒槐花及槐花炭UPLC指纹图谱见图1～3。16批槐花生品标定了15个共有峰,16批炒槐花标定了16个共有峰,16批槐花炭标定了14个共有峰,其中:峰1和峰2(5-羟甲基糠醛)在槐花生品中均未检出,在炒槐花中均能检出;峰1在部分批次槐花炭中能检出,峰2(5-羟甲基糠醛)在槐花炭中均能检出;峰17在槐花生品中均能检出,但在炒槐花和槐花炭中均未检出。由此说明槐花生品、炒槐花、槐花炭3者的化学成分组成差异较大,且峰1、峰2(5-羟甲基糠醛)和峰17可用于区分3者。

图1 16批槐花生品UPLC指纹图谱

图2 16批炒槐花UPLC指纹图谱

图3 16批槐花炭UPLC指纹图谱

2.6.2 色谱峰指认 取“2.3”项下的对照品溶液,按“2.2”项下色谱条件进样测定,采集色谱图。通过与对照品色谱图的对比,指认了峰2、峰3、峰8、峰9、峰10、峰11、峰14、峰15分别为5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、槲皮素、山柰素。槐花生品、炒槐花及槐花炭的对照图谱见图4,对照品图谱见图5。

图4 槐花生品(H-R)、炒槐花(C-R)和槐花炭(T-R)对照图谱

注:2.5-羟甲基糠醛;3.原儿茶酸;8.芦丁;9.异槲皮苷;10.山柰酚-3-O-芸香糖苷;11.水仙苷;14.槲皮素;15.山柰素

2.6.3 相似度评价 分别以槐花生品、炒槐花及槐花炭的对照图谱为参照,计算16批槐花生品、炒槐花及槐花炭的相似度,结果见表2。16批槐花生品的相似度范围为0.996～1.000,16批炒槐花的相似度范围为0.999～1.000,16批槐花炭的相似度范围为0.979～1.000,表明槐花样品批间质量差异较小,且炮制后的样品批间质量也较稳定。

表2 16批槐花生品、炒槐花及槐花炭的UPLC指纹图谱相似度

2.7 槐花生品与炮制品的色度值测定

采用分光测色仪对16批槐花生品与炮制品的样品粉末色度值进行测定,光源设置为D65,视场选择10度视角,测定孔径4 mm,进行仪器黑白校正后,分别取16批槐花生品、炒槐花、槐花炭粉末适量,均匀平铺于载玻片上,平铺的厚度约为1 mm,测定粉末色度值L*、a*、b*,平行测定3 次,取平均值。16批槐花生品、炒槐花及槐花炭样品粉末色彩图像见图6,色度值结果见表3。

图6 16批槐花生品、炒槐花及槐花炭样品粉末色彩图像

表3 16批槐花生品与炮制品的色度值结果

表4 16批槐花生品到炮制品色度值变化结果

2.8 槐花生品与炮制品的多元统计分析

2.8.1 单因素方差分析 将16批槐花生品及炮制品UPLC指纹图谱的17个共有峰的峰面积(缺失的色谱峰峰面积以0计)按峰面积/称样量/1 000计算比值后与色度值(L*、a*、b*)导入SPSS20.0软件,进行单因素方差分析,结果见表5。结果表明,与槐花生品相比,炒槐花中的峰1、2、3、7、8、9、10、12、13、14、16、17的峰面积/称样量/1 000比值及色度值(L*、a*)差异均具有统计学意义(P<0.05);与槐花生品相比,槐花炭中的峰1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、15、17的峰面积/称样量/1 000比值及色度值(L*、a*、b*)差异均具有统计学意义(P<0.05);与炒槐花相比,槐花炭中的峰1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16的峰面积/称样量/1 000比值及色度值(L*、a*、b*)差异均具有统计学意义(P<0.05),这说明槐花生品经炮制后其内在质量与外在颜色均发生了较大的变化,其中炒炭后变化较为明显。

表5 槐花生品与炮制品共有峰的峰面积/称样量/1 000比值及色度值方差分析结果

2.8.2 聚类分析及主成分分析 将16批槐花生品及炮制品UPLC指纹图谱的17个共有峰的峰面积(缺失的色谱峰峰面积以0计)按峰面积/称样量/1 000计算比值后与色度值(L*、a*、b*)导入SIMCA 14.1软件,进行聚类分析和主成分分析。结果提取到3个特征值大于1的主成分,其中主成分1的方差贡献率为51.629%,主成分2的方差贡献率为27.095%,主成分3的方差贡献率为11.456%,3个主成分累积方差贡献率为90.179%,说明提取到的3个主成分即可反映槐花生品、炒槐花及槐花炭UPLC指纹图谱90.179%的信息,结果见表6。

表6 特征值、方差贡献率及累积方差贡献率

聚类分析树状图(图7)和主成分分析二维得分图(图8)均可明显区分槐花生品、炒槐花和槐花炭。

图7 16批槐花生品及炮制品聚类分析树状图

图9 16批槐花生品及炮制品的OPLS-DA得分图

图10 16批槐花生品及炮制品VIP值图

2.9 槐花炒制过程指纹图谱与色度值动态变化分析

2.9.1 槐花炒制过程饮片样品的制备 取槐花药材(H1),按2020年版《中国药典》槐花炮制项下规定,除去杂质及灰屑,得槐花饮片。将电磁炉温度加热至160 ℃左右时,投入槐花饮片,自0 min起,每间隔2 min取样1次(共炒制46 min),放冷,得24份不同取样时间点的槐花炒制的饮片样品。

2.9.2 指纹图谱的采集 分别取上述24份不同取样时间点槐花炒制的饮片样品粉末,按“2.4”项下方法制备供试品溶液,按“2.2”项下色谱条件进样测定,记录每份样品的色谱图和17个色谱峰的峰面积,缺失的色谱峰峰面积以0计,所得峰面积按峰面积/称样量/1 000计算比值,结果见表7。24份不同取样时间点的样品UPLC指纹图谱见图11。

图11 槐花炒制过程不同取样时间点饮片样品UPLC指纹图谱

由表7可知,峰1～2在0 min时峰面积/称样量/1 000比值为0,炒制2 min时该比值分别为10、4,由此推测峰1和峰2为炒制过程中新增的化合物。在46 min内,随着炒制时间的延长,峰1～峰16峰面积/称样量/1 000比值整体上均呈现先增大后减小的规律,峰17则呈现一直减小的规律,其中有7个色谱峰(峰1、4、5、6、7、13、17)分别在炒制18、46、32、44、32、30、10 min时峰面积/称样量/1 000比值下降为0,其余色谱峰在炒制一段时间后峰面积/称样量/1 000比值也发生了不同程度的下降,表明槐花在炒制过程中其化学成分受热极不稳定,同时也说明了控制炮制时间对化学成分的保留至关重要,以保证临床用药的有效性。

由“2.6.2”项下结果可知,峰2、峰3、峰8、峰9、峰10、峰11、峰14、峰15分别指认为5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、槲皮素、山柰素,其中芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、槲皮素、山柰素,均为黄酮类成分。研究表明,黄酮类成分具有抑菌抗炎、抗自由基、抗氧化等多种生物活性,是槐花生品及其炮制品的主要药效成分。峰8(芦丁)、峰10(山柰酚-3-O-芸香糖苷)和峰11(水仙苷)的峰面积/称样量/1 000比值在炒制0～8 min内均变化不大,在2 min左右均处于最大值,与0 min时相比,炒至46 min时该比值分别下降了99%、99%、97%;峰15(山柰素)在6 min左右峰面积/称样量/1 000比值达到最大值,其中0～8 min内变化不明显;峰14(槲皮素)在8 min左右峰面积/称样量/1 000比值达到最大值,其中4～8 min内变化不明显,与0 min时相比,炒至46 min时该比值下降了74%;峰9(异槲皮苷)在10 min左右峰面积/称样量/1 000比值达到最大值。表明槐花主要黄酮类成分在炒制10 min内含量可达到最大值,峰8(芦丁)为槐花最主要的有效成分,其峰面积/称样量/1 000比值最大,在炒制2 min左右该比值已达到最大。

峰2(5-羟甲基糠醛)为炒制2 min内新产生的化合物,在12 min左右峰面积/称样量/1 000比值达到最大值,峰3(原儿茶酸)在8 min左右峰面积/称样量/1 000比值达到最大值。相关药理研究表明,5-羟甲基糠醛具有双向的作用,在具有较好的抗氧化、抗炎、抗过敏、保护神经细胞等作用的同时,也具有刺激眼睛、黏膜、皮肤,神经毒性等毒副作用[9-11]。因此,在炮制过程中控制5-羟甲基糠醛的含量对临床用药的安全性亦不可忽视。

图12 槐花炒制过程不同取样时间点饮片样品粉末色彩图像

图13 槐花炒制过程中色度值的变化情况

结果显示,槐花炒制过程中,0～46 min内明度值L*、黄蓝色值b*以及总色值E*总体均呈现下降趋势,其中下降最明显的为明度值L*,下降幅度为54,下降了约84%,黄蓝色值b*在0～8 min变化不大,8～46 min下降明显,0～46 min下降幅度为26,下降了约81%,红绿色值a*则先增大后减小,但整体变化不明显,表明样品明度由亮变暗,颜色由黄色到焦黑色转变。色差ΔE*随着炒制时间的延长呈现不断升高的趋势,其值越大,代表与参照样品色值相差越大,当炒制2 min时样品ΔE*=8,大于3.5[6],表明炒制2 min时饮片颜色变化即可被肉眼识别。炒制4～6 min时,饮片的色度值L*、a*、b*、E*基本落在“2.7”项下炒槐花的色度值浮动范围内,故以饮片色泽为评价指标时,在160 ℃的炒制温度下,炒槐花的炒制时间以4～6 min为宜。炒制14～18 min时,饮片的色度值L*、a*、b*、E*基本落在“2.7”项下槐花炭的色度值浮动范围内,故以饮片色泽为评价指标时,在160 ℃的炒制温度下,槐花炭的炒制时间以14～18 min为宜。

2.10 槐花炒制过程关键指标成分的相对含量与色度值的相关性分析

“2.8.3”项下结果表明,芦丁和槲皮素的相对含量是槐花生品、炒槐花、槐花炭差异的关键指标。此外,5-羟甲基糠醛也是炮制后新增的化学成分。因此,为验证槐花炮制过程中,上述指标成分相对含量与饮片色度值的关联性,本研究采用SPSS20.0对槐花炒制过程关键指标成分5-羟甲基糠醛、芦丁、槲皮素的相对含量与色度值进行Pearson相关性分析,结果见表8。结果显示,槐花炮制过程中,5-羟甲基糠醛的相对含量与色度值a*及色差值Δa*呈显著正相关;芦丁和槲皮素的相对含量与色度值L*、a*、b*、E*及色差值ΔL*、Δa*、Δb*呈显著正相关,与色差值ΔE*呈显著负相关。

图14 槐花炒制过程中色差值的变化情况

表8 槐花炒制过程中关键指标成分的相对含量与色度值的相关性

3 讨论

3.1 槐花生品、炒槐花及槐花炭的指纹图谱与色度值分析

传统的饮片炮制主要是依赖于人的感官与经验,通过判断饮片的外观颜色从而决定饮片的炮制终点,这存在一定的主观性和模糊性。1976年由照明委员会(CIE)提出的CIELAB均匀颜色空间理论,可以实现对颜色的准确描述,使样品颜色可以量化表达,已广泛应用于印染颜料制造、涂料、塑料着色等领域中[12]。近年来,基于该理论,不少学者利用色差仪测定中药的外观颜色以获取样品的色度值,从而对样品颜色进行客观量化,用于弥补传统中药鉴别中对颜色判断的不足。

本研究根据现行版《中国药典》槐花项下规定,对炒槐花和槐花炭进行了炮制,并基于CIELAB均匀颜色空间理论,采用分光测色仪对槐花生品、炒槐花以及槐花炭的颜色进行量化。在炒槐花和槐花炭炮制过程中,不仅存在颜色的变化,同时也会伴随着化学成分组成与含量的变化,外在颜色是判断炒槐花及槐花炭炮制程度的重要参考指标,而内在化学成分含量则是评价二者质量的重要依据。因此,本研究基于UPLC指纹图谱与色度值,对槐花炮制前后饮片的差异进行多元统计分析。

由单因素方差分析结果可知,槐花生品、炒槐花、槐花炭不仅外观颜色有差异,化学成分的组成与含量也存在较大差异,峰1和峰2(5-羟甲基糠醛)为炒黄后产生的化学成分,而峰17则为炒黄和炒炭后消失的成分。槐花生品具有很强的清肝泻火、清热凉血作用,多用于血热妄行,肝热目赤,头痛眩晕,疮毒肿痛;炒槐花苦寒之性缓和,清热凉血作用减弱,止血作用增强但弱于槐花炭,多用于脾胃虚弱的出血患者;槐花炭清热凉血作用极弱,涩性增强,以止血力胜,多用于咯血、便血、崩漏下血等出血证。故在临床使用时,止血多炒炭用,而清热泻火则生用,这可能与槐花经过炮制后化学成分的组成与含量发生变化有关[3]。

聚类分析、主成分分析以及OPLS-DA均可将槐花生品、炒槐花和槐花炭明显区分,且芦丁和槲皮素是引起槐花生品、炒槐花和槐花炭之间差异的主要成分。芦丁为槐花生品及其炮制品中含量最高的黄酮类成分,其次是槲皮素,因此,槐花生品、炒槐花及槐花炭中芦丁和槲皮素含量的差异可能是导致3者临床疗效差异的主要原因之一。

3.2 槐花炮制过程的指纹图谱与色度值动态变化分析

为了进一步明确各色谱峰的峰面积随炮制时间的延长其变化趋势以及炮制过程中饮片颜色的变化情况,本研究对槐花炒制46 min内17个色谱峰的峰面积/称样量/1 000比值和颜色值进行了研究。结果表明,炒制过程中峰1～16的峰面积/称样量/1 000比值均先增大后减小,峰17则一直减小,17个色谱峰的峰面积/称样量/1 000比值在炒制12 min内均可达到最大值。在颜色变化方面,炒制过程中槐花饮片的外观明亮度由明到暗,颜色由黄色到焦黑色转变。5-羟甲基糠醛是葡萄糖等单糖在高温或弱酸等条件下脱水产生的化合物[13],槐花炒制过程中5-羟甲基糠醛含量的升高可能是导致样品颜色加深的原因。此外,芦丁等黄酮类成分是槐花黄色素的主要成分,其在炒制一段时间后含量明显下降,二者共同作用可能是导致L*和b*明显降低的原因,故槐花炒制过程中样品表观颜色逐渐加深,整体从黄色到焦黑色转变。

综上,本研究建立的UPLC指纹图谱结合色度值的方法可有效区分槐花生品、炒槐花和槐花炭,同时考察了槐花随炮制时间的延长UPLC指纹图谱与色度值的动态变化情况,可为槐花生品及其炮制品的鉴别以及炮制工艺研究提供参考。