基于miR-495/FTO 通路介导的巨噬细胞极化探讨芪参汤改善胰岛素抵抗治疗2 型糖尿病的分子机制

2023-08-12孙志东高佳炜杨柳欣张雅丽袁星星

海南医学院学报 2023年14期

孙志东，高佳炜，杨柳欣，张雅丽，3，袁星星，

（1.黑龙江省中医药科学院，黑龙江哈尔滨 150006；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040；3.张雅丽名老中医药专家工作室，黑龙江哈尔滨 150006）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一种由环境与遗传等因素共同作用引起的，以胰岛素分泌相对减少伴胰岛素抵抗为主要病理生理特征的代谢性疾病［1］。30 多年来，我国糖尿病的患病率显著增加，已成为严重的公共卫生问题之一，其中T2DM 约占我国糖尿病的90%以上，不仅给患者带来极大的危害，也给社会带来巨大的经济负担［2］。

巨噬细胞是人体重要的固有免疫细胞，在机体微环境改变的同时其功能发生变化，包括经典激活的M1 型和交替激活的M2 型。巨噬细胞极化在包括肥胖、T2DM、非酒精性脂肪性肝病和痛风等代谢性疾病的发生与发展中发挥着重要的作用［3］。研究证实，脂肪巨噬细胞构成的炎性浸润在诱导胰岛素抵抗-T2DM 这一病理过程中的作用不容忽略［4］。因此，调控巨噬细胞极化介导的炎症微环境可能是改善胰岛素抵抗的重要途径。芪参汤已被证实能够改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗，从而促进糖脂代谢和降低体质量，然而具体机制仍不明确［5，6］。本研究以佛波酯诱导THP-1 人单核细胞株分化巨噬细胞，并采用高糖刺激构建巨噬细胞极化模型，通过观察芪参汤对miR-495/FTO 信号通路介导的巨噬细胞极化的影响，从而阐明芪参汤改善胰岛素抵抗治疗T2DM 的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞

20 只健康清洁级SD 大鼠（雄性，6 周龄，201～225 g）购于北京维通利华有限公司，实验动物生产许可证：京瓦窑 SCXK（京）2021-0011。动物饲养于黑龙江省中医药科学院动物实验中心，室温20～25 ℃，循环光照，自由饮水。THP-1（人单核细胞白血病）细胞株购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 药物与试剂

芪参汤（生黄芪15 g、西洋参10 g、泽泻10 g、荷叶10 g、生山楂10 g、丹参10 g、女贞子8 g、墨旱莲8 g、绞股蓝5 g、三七5 g、生甘草3 g）购于黑龙江生中医药科学院中草药局，药物经煎煮、过滤后制成1 g/mL 的浓缩液备用。佛波酯购于中国Biosharp 公司（货号：BL1127A）；RPMI-1640 培养液和高糖培养基购于武汉普诺赛生命科技有限公司（货号分别为PM150110B 和PM150210B）。CD86 和CD206 一抗均购于英国Abcam 公司（ab239075 和ab270647）；FTO 一抗、β-Actin 一抗、HRP 标记的二抗、ECL 化学发光试剂盒和BCA 蛋白检测试剂盒购于美国CST 公司（货号分别为#31687、#93473、#7074、#6883 和#7780）。白细胞介素4（Interleukin-4，IL-4）、IL-6、IL-1β 和IL-10 检测试剂盒购于江苏酶免实业有限公司（货号分别为MM -0051H2、MM -0049H2、MM-0181H2 和MM-0066H2）。Lipo6000转染试剂盒购于上海碧云天生物（货号：C0526-10ml）；qPCR 试剂盒购于美国Roche 公司（货号：KK4610）。

1.3 方法

1.3.1 含药血清制备大鼠适应性饲养1 周后随机分为空白组与模型组，各10 只。参照前期研究［7］方法，芪参汤组给予芪参汤浓缩液（18.8 g/kg）灌胃治疗，空白组给与等体积的生理盐水灌胃治疗，每日1次，连续7 d。于末次治疗后腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血。3 500 r/min 离心10 min 后收集血清，水浴灭活30 min 后，滤膜过滤后备用。

1.3.2 细胞培养 THP-1 以RPMI-1640 培养液（含有10%FBS、1%青-链霉素双抗和β-巯基乙醇）进行培养，将细胞置于37 ℃和含5%CO2的培养箱中配，2～3 d 换液1 次。当细胞处于对数生长期时，将细胞接种于6 孔板（1×106个/mL）。向细胞中加入佛波酯（160 nmol/L）诱导THP-1 向巨噬细胞分化，当细胞以悬浮状态转为贴壁状态，表示细胞分化成功。

1.3.3 细胞分组与药物干预将分化后的巨噬细胞以2.5×105个/mL 的密度接种于6 孔板，每孔900 μL。参照方案进行分组并给予相应的药物进行干预。（1）空白组：THP-1+正常培养基（5.6 mmol/L葡萄糖）+100 μL 空白血清；（2）模型组：THP-1+高糖培养基（30 mmol/L 葡萄糖）+100 μL 空白血清；（3）芪参汤组：THP-1+高糖培养基（30 mmol/L葡萄糖）+100 μL 含药血清；（4）miR-495 抑制物组：THP-1+高糖培养基（30 mmol/L 葡萄糖）+100 μL空白血清+miR-495 inhibitor；（5）芪参汤+miR-495抑制物组：THP-1+高糖培养基（30 mmol/L 葡萄糖）+100 μL 含药血清+miR-495 inhibitor。其中miR-495 inhibitor 由上海吉玛制药技术有限公司代合成，参照Lipo6000 试剂盒说明书将终浓度为200 nmol/L 的miR-495 inhibitor 转染至巨噬细胞。

1.3.4 CCK8 法检测将分化后的巨噬细胞以2.5×105个/mL 的密度接种于6 孔板，参照方案进行分组并给予相应的药物进行干预，以检测芪参汤含药血清和转染miR-495 inhibitor 对巨噬细胞的毒性。（1）空白组：THP-1+正常培养基（5.6 mmol/L葡萄糖）；（2）空白血清组：THP-1+正常培养基（5.6 mmol/L 葡萄糖）+100 μL 空白血清；（3）含药血清组：THP-1+正常培养基（5.6 mmol/L 葡萄糖）+100 μL 含药血清；（4）miR-495 抑制物组：THP-1+正常培养基（5.6 mmol/L 葡萄糖）+miR-495 inhibitor。没孔加入10 μL 的CCK8 溶液，于37 ℃的环境下培养4 h，通过酶标仪检测各孔的吸光度值（A450）。

1.3.5 ELISA 法检测于48 h 后收集1.3.3 中各组巨噬细胞培养液，采用ELISA 试剂盒检测各组培养液上清中IL-6、IL-1β、IL-4 和IL-10 的含量，实验操作在试剂盒说明书指导下进行。

1.3.6 流式细胞术检测于48 h 后收集1.3.3 中各组巨噬细胞，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入PBS 重悬后1 000 r/min 离心5 min，PBS 洗涤2 次后分为2 组。一组加入200 μL 的PBS 重悬后加入FITC 标记的CD86 的抗体进行孵育；另一组加入200 μL 的PBS 重悬后加入1.5 mL 破膜剂，加入FITC 标记的CD206 的抗体进行孵育。孵育30 min后以PBS 洗涤、重悬后上机检测CD86 和CD206 的阳性表达率。

1.3.7 qPCR 检测于48 h 后收集1.3.3 中各组巨噬细胞，采用TRIzol 法提取细胞中总RNA，随后逆转录合成cDNA。按照qPCR 试剂盒方法进行mRNA 的定量分析。引物序列如下：miR-495：F：5'-GCGAAACAAACATGGTGC-3'，R：5'-GCAG GGTCCGAGGTATTC-3'；U6：F：5'-CTCGCTT CGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAA TTTGCGT-3'；FTO：5'-TTCATGCTGGATG ACCTCAATG-3'，R：5'-GCCAACTGACAGCG TTCTAAG - 3'；GAPDH：F：5'- GCACCGTC AAGGCTGAGAAC-3'，R：5'-TGGTGAAGACG CCAGTGGA-3'。qPCR 的反应条件如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性20 s，58 ℃变性30 s，72 ℃延伸45 s，循环40 次后以95 ℃终末延伸15 s，4 ℃保持。miR-495 以U6 作为内参，FTO 以GAPDH 作为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-495 与FTO 的相对表达量。

1.3.8 Western blot 检测于48 h 后收集1.3.3 中各组巨噬细胞，提取总蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白浓度。上样、电泳、转膜后以脱脂牛奶于室温下进行封闭。加入FTO（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育过夜，加入二抗于室温下继续孵育2 h。TBST 洗膜后加入ECL 显影，化学发光检测系统拍照后分析FTO 的相对表达水平。

1.4 统计学处理

采用SPSS 26.0 软件进行数据分析，多组间比较采用ANOVA，组间两两的比较采用LSD 检验。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 芪参汤对巨噬细胞活性的影响

为了明确空白血清、芪参汤含药血清和转染miR-495 抑制物对巨噬细胞的毒性，本研究采用CCK8 法检测巨噬细胞的活性。与本组12 h 相比，24 h 和48 h细胞的活性均显著增加，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。各时间段组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；与空白组相比，空白血清、芪参汤含药血清和转染miR-495 抑制物的巨噬细胞活性均无明显变化，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 芪参汤对巨噬细胞活性的影响（n=3，±s，OD）Tab 1 Effect of Qishen decoction on macrophage activity（n=3，±s，OD）

注：与本组12 h 相比，*P＜0.05。

分组空白组空白血清组含药血清组miR-495 抑制物组48 h 0.847±0.165*0.852±0.080*0.870±0.053*0.849±0.081*0.030 0.916 FP 12 h 0.633±0.013 0.634±0.040 0.627±0.075 0.627±0.044 0.022 0.995 24 h 0.740±0.021*0.747±0.020*0.750±0.020*0.746±0.035*0.086 0.966

2.2 芪参汤对巨噬细胞炎症因子含量的影响

与空白组相比，模型组IL-6 和IL-1β 的含量均显著增加，IL-4 和IL-10 的含量均显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，芪参汤组、miR-495 抑制物组和芪参汤+miR-495 抑制物组上清中IL-6 和IL-1β 的含量均显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，芪参汤组、miR-495 抑制物组和芪参汤+miR-495 抑制物组上清中IL-4 和IL-10 的含量均显著增加，差异均具有统计学意义（P＜0.05 和P＜0.01）。见表2。

表2 芪参汤对巨噬细胞炎症因子含量的影响（n=3，±s，pg/mL）Tab 2 Effect of Qishen decoction on inflammatory factors in macrophages（n=3，±s，pg/mL）

注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，○P＜0.05，○○P＜0.01。

分组空白组模型组芪参汤组miR-495 抑制物组芪参汤+miR-495 抑制物组IL-6 7.93±0.78 24.58±2.15**16.48±2.88○○17.99±3.29○○9.78±1.37○○IL-1β 18.04±3.35 57.66±9.69**40.25±5.63○○39.25±6.81○○22.67±1.83○○IL-4 23.23±0.93 8.91±1.26**13.69±1.87○○13.10±1.38○19.05±2.63○○IL-10 70.07±8.98 28.43±4.19**40.12±1.30○○40.22±2.06○52.60±2.48○○33.981＜0.001 FP 25.662＜0.001 20.051＜0.001 31.628＜0.001

2.3 芪参汤对巨噬细胞表型的影响

与空白组相比，模型组巨噬细胞CD68 的表达和CD68/CD206 的比值均显著增加，CD206 的表达显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，芪参汤组、miR-495 抑制物组和芪参汤+miR-495 抑制物组巨噬细胞CD68 的表达和CD68/CD206 的比值均显著降低，CD206 的表达均显著增加，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。见表3 和图1。

图1 各组巨噬细胞CD86 和CD206 表达的比较Fig 1 Comparison of CD86 and CD206 expression in macrophages

表3 芪参汤对巨噬细胞表型的影响（n=3，±s）Tab 3 Effect of Qishen decoction on macrophage phenotype（n=3，±s）

注：与空白组相比，**P＜0.01；与模型组相比，○○P＜0.01。

分组空白组模型组芪参汤组miR-495 抑制物组芪参汤+miR-495 抑制物组CD68（%）21.26±1.38 53.53±3.05**38.05±3.14○○37.61±5.73○○30.49±2.05○○CD206（%）24.01±3.16 11.20±1.69**19.64±4.15○○20.85±3.24○○29.08±1.98○○CD68/CD206 的比值0.90±0.16 4.84±0.46**2.01±0.52○○1.81±0.27○○1.05±0.06○○65.063＜0.001 FP 36.219＜0.001 14.535＜0.001

2.4 芪参汤对巨噬细胞标记分子表达的影响

与空白组相比，模型组巨噬细胞iNOS 和COX-2 的表达均显著增加，Arg-1 和YM-1 的表达均显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，芪参汤组、miR-495 抑制物组和芪参汤+miR-495 抑制物组巨噬细胞iNOS 和COX-2 的表达均显著降低，Arg-1 和YM-1 的表达均显著增加，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。见表4。

表4 芪参汤对巨噬细胞极化标记分子表达的影响（n=3，±s）Tab 4 Effect of Qishen decoction on the expression of macrophage marker molecules（n=3，±s）

注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，○P＜0.05，○○P＜0.01。

分组空白组模型组芪参汤组miR-495 抑制物组芪参汤+miR-495 抑制物组Arg-1 1.00±0.00 0.25±0.07**0.64±0.07○○0.67±0.09○○0.93±0.05○○YM-1 1.00±0.00 0.34±0.05**0.66±0.07○○0.68±0.05○○0.88±0.04○○84.613＜0.001 FP iNOS 1.00±0.00 3.14±0.18**2.43±0.08○○2.45±0.14○○1.75±0.10○○143.029＜0.001 COX-2 1.00±0.00 2.80±0.12**2.41±0.08○○2.39±0.13○○1.45±0.09○○191.093＜0.001 64.004＜0.001

2.5 芪参汤对MiR-495 和FTO 表达的影响

与空白组相比，模型组巨噬细胞中miR-495 的表达均显著增加，FTO 的表达均显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，芪参汤组、miR-495 抑制物组和芪参汤+miR-495 抑制物组巨噬细胞中miR-495 的表达均显著降低，FTO 的表达均显著增加，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。见表5。

表5 芪参汤对巨噬细胞miR-495 和FTO 表达的影响（n=3，±s）Tab 5 Effect of Qishen decoction on the expression of miR-495 and FTO（n=3，±s）

注：与空白组相比，**P＜0.01；与模型组相比，○○P＜0.01。

分组空白组模型组芪参汤组miR-495 抑制物组芪参汤+miR-495 抑制物组miR-495 的相对表达1.00±0.00 2.70±0.09**2.30±0.06○○2.37±0.05○○FTO 的相对表达1.00±0.00 0.21±0.03**0.49±0.03○○0.50±0.05○○1.42±0.03○○0.76±0.04○○271.386＜0.001 FP 504.084＜0.001

2.6 芪参汤对FTO 蛋白表达的影响

与空白组相比，模型组巨噬细胞中FTO 蛋白的表达均显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，芪参汤组、miR-495 抑制物组和芪参汤+miR-495 抑制物组巨噬细胞中FTO蛋白的表达均显著增加，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。见表6。

表6 芪参汤对巨噬细胞FTO 蛋白表达的的影响（n=3，±s）Tab 6 Effect of Qishen decoction on FTO protein expression（n=3，±s）

注：与空白组相比，**P＜0.01；与模型组相比，○○P＜0.01。

FTO/β-actin 0.82±1.36 0.20±0.03**0.51±0.03○○0.50±0.06○○0.71±0.03○○128.495＜0.001分组空白组模型组芪参汤组miR-495 抑制物组芪参汤+miR-495 抑制物组FP

图2 各组巨噬细胞中FTO 蛋白表达的比较Fig 2 Comparison of FTO protein expression in macrophages of each group

3 讨论

胰岛素抵抗作为T2DM 的重要病理机制，同时也被证实在代谢综合征中发挥着重要的作用。肥胖可导致脂肪细胞的体积增大，增大的脂肪细胞引起脂肪组织的缺氧，从而诱发细胞功能障碍（如内质网应激和氧化应激反应）并启动炎症反应；另一方面，肥大的脂肪细胞通过分泌的单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）与肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor- α，TNF-α）导致糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗［8］。除脂肪组织巨噬细胞外，在MCP-1 和B 细胞、T 细胞的趋化作用下，来自单核细胞分化的巨噬细胞在坏死脂肪细胞周围浸润的巨噬细胞是糖尿病慢性炎症的标志［9］。

巨噬细胞功能存在显著的异质性，在局部微环境的影响下其表型发生着动态转化。M1 型巨噬细胞以CD68、iNOS 和COX2 为主要标记分子，通过分泌IL-6、IL-1β 及TNF-α 等促炎因子，发挥免疫监控的作用。iNOS 是炎症反应的重要组成部分，通过下调胰岛素信号分子Rab8 的表达水平参与胰岛素抵抗的形成［10］。COX2 是前列腺素合成过程中的重要限速酶，其表达水平与炎症反应及肿瘤的形成密切相关。有研究证实，COX2 可诱导胰岛内的炎症水平，进而引起胰岛β 细胞功能的损伤［11］。M2 型巨噬细胞以CD206、Arg-1 和YM-1 阳性表达为主表标记分子，通过分泌IL-4 及IL-10 等细胞因子，发挥抗炎的作用。本研究结果显示，高糖诱导巨噬细胞以M1 型分化为主，并分泌大量的IL-6 和IL-1β。芪参汤含药血清能够显著上调巨噬细胞中CD206、Arg-1 和YM-1 的表达，并下调CD68、iNOS 和COX2 的表达水平，从而促进巨噬细胞的M1 向M2型分化，从而发挥抗炎的作用。

微小RNA（miRNA）是真核生物内的一类小分子非编码RNA，约19～25 个核苷酸大小。在Dicer酶的作用下，70～90 nt 的发夹结构的单链RNA 前体被加工形成miRNA，其通过识别并特异性地结合mRNA 的3'UTR，从而在转录后水平上抑制mRNA的翻译或者促进mRNA 的降解，发挥病理生理作用。越来越多的研究证实miRNA 的表达通过影响胰岛素抵抗或调控胰岛β 细胞的功能参与葡萄糖的代谢［12］。此外，miRNA 还可通过转录后调控参与巨噬细胞的极化，进而对免疫反应、胰岛素抵抗与炎症等发挥治疗作用［13］。miR-495 已被证实在巨噬细胞中表达，并对血管再狭窄、氧化应激的调控和巨噬细胞极化中发挥着积极的作用［14-16］。FTO 是miR-495 下游重要的靶基因。作为脂肪和肥胖相关基因，FTO 与糖尿病、脂肪肝、肥胖等代谢性疾病的发生与发展存在着密切的关系。研究证实，过表达FTO 可引起体重的增加与糖尿病等［17］。然而，FTO 在不同细胞中的作用可能相反。研究证实，FTO 在通过调控肝脏中糖生成基因的表达从而参与机体糖稳态的调节［18］。当前的研究证实，在高糖诱导的巨噬细胞模型中miR-495 的表达水平显著增加，通过抑制miR-495 的表达能够显著上调FTO 的表达，从而促进M1 型巨噬细胞向M2 型转化，发挥抗炎的作用。

芪参汤为临床治疗代谢综合征的经验方，该方以黄芪、西洋参为君，其中黄芪具有补气固表，西洋参养阴生津，两者合用具有补气养阴、清热生津的功效。研究证实，黄芪中的黄芪多糖能够通过上调骨骼肌中的PI3K 和降低血清总胆固醇和甘油三酯的水平，达到改善肥胖大鼠的胰岛素抵抗的作用［19］。方中以泽泻、荷叶入脾、肾经，渗湿、泄热，生山楂、丹参入肝、脾、胃经，健脾消食、行气散瘀，以上四药，共为臣药。周熠等［20］通过网络药理学表明，荷叶可通过胰岛素抵抗通路、ErbB 信号通路及胰岛素信号转导通路等协调发挥治疗T2DM 的作用。而丹参的主要活性成分丹参酮Ⅰ可通过抑制PTP1B 的表达，从而促进AKT 信号通路的活化，改善胰岛素抵抗［21］。女贞子、墨旱莲滋补肝肾，绞股蓝补虚清热，三七活血祛瘀，以上四药共为佐药。药理学研究证实，绞股蓝及其等效成分如绞股蓝多糖、绞股蓝皂苷等能够调节糖脂代谢、恢复肠道菌群稳态、改善胰岛素抵抗和抗氧化的作用，在糖尿病的治疗中发挥着重要作用。甘草解毒、调和药性，作为使药。全方共奏益气养阴、消食散瘀的功效。本研究结果证实芪参汤对巨噬细胞的活性无明显毒副作用，该结果提示芪参汤抗炎的作用不是通过抑制巨噬细胞活性实现的。进一步药理学研究结果显示芪参汤能够显著增加M2 型巨噬细胞的比例，降低M1 型巨噬细胞的比例，从而降低IL-6 和IL-1β 的水平，增加IL-4 和IL-10 的水平，发挥抗炎的作用。机制角度，芪参汤能够显著抑制巨噬细胞中miR-495 的表达，上调FTO 的表达水平，从而巨噬巨噬细胞M1 向M2 型极化，其药理学作用与miR-495 抑制物趋势相同，两者联用和发挥协同作用。

综上所述，在前期研究的基础上，进一步阐明了芪参汤改善胰岛素抵抗的分子机制及靶点。研究结果表明，芪参汤通过miR-495/FTO 通路促进巨噬细胞的M2 型分化，从而发挥抗炎机制，达到改善胰岛素抵抗的作用。

作者贡献度说明：

袁星星：设计实验；高佳炜、杨柳欣执：行细胞实验和指标检测；孙志东：负责统计分析和文稿撰写；张雅丽：进行最后校审。

所有作者声明不存在利益冲突关系。