苯烯莫德抑制非小细胞肺癌细胞A549 的增值并诱导其凋亡

高二可，钱 峰，金齐力

（1.蚌埠医学院，安徽 蚌埠 233004；2.蚌埠医学院第二附属医院，安徽 蚌埠 233004）

肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤［1］。在我国确诊的肺癌患者中，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer cell，NSCLC）约占八成［2］。让人遗憾的是，NSCLC 的预后差，很多患者在确诊时就已经发展到晚期或出现转移，五年生存率仅约为百分之十五，严重影响人类的健康安全［3，4］。化疗是临床治疗非小细胞肺癌的常见治疗方案，但化疗药物的敏感性低，治疗效果不理想。随着分子靶向药的出现，NSCLC 的治疗效果显著提升。但临床上多数患者在使用靶向药后，出现基因突变，导致耐药的产生，因此需要开发新的靶向药来解决相应的治疗问题。

芳香烃受体（aromatic hydrocarbon receptor，AhR）存在于细胞质中，需依赖配体激活来发挥功能，是碱性螺旋-环-螺旋-Per/Arnt/Sim（bHLH-PAS）蛋白家族的一员，其bHLH 结构域是与DNA 结合发挥转录功能的常见成分，而另一部分两个PAS 结构域则分别与AhR 受体结合及与AhR 核易位子（ARNT）形成二聚体［5］。在静息状态下，AhR 在细胞质中与两个热休克蛋白90（HSP90）、乙型肝炎X相关蛋白2（XAP2）和前列腺素E 合成酶3（P23）形成复合体［6］。配体与其结合并激活后，AhR 在细胞核内发生穿梭，转位到细胞核内，穿梭的过程中HSP90 被分离出去，从而暴露出PAS 结构域与AhR 结合，以调节不同异种生物反应元件的表达。除此之外，AhR 还被证明与增殖、发育和免疫调节有关基因的转录有关［7］。有研究证实AhR 的激活通过增加CDK 抑制物P27kip1 的表达来抑制肝癌细胞的增殖［8］。也有研究证实，AhR 激动剂四氯二苯并二恶英（tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）（0.1～100 nmol/L）的处理显著减少了人结肠癌细胞的集落形成和增殖［9］。犬尿氨酸作为AhR 激动剂，也被报道过通过激活AhR 而抑制肿瘤细胞的生长。因此，AhR 有可能会成为未来治疗肿瘤的靶点之一。

苯烯莫德是一种新型的、来源于具有发光特性的革兰氏阴性杆菌的作用局部的AhR 激动剂［10］。目前苯烯莫德1% 乳膏（VTAMA®）于2022 年5 月获得美国FDA 批准，用于成人斑块型银屑病的局部治疗。它能与多种细胞类型的AhR 特异性结合并激活AhR，包括CD4+T 细胞、HaCaT 细胞和人类皮肤移植物［11，12］。目前的研究表明苯烯莫德通过激活AhR 调节细胞因子和皮肤屏障蛋白的表达以及抗氧化活性，促进皮肤屏障的正常化［13，14］。然而现阶段国内外对于苯烯莫德的机制研究仅限于其激活AhR，调节免疫和抗炎维护皮肤屏障完整性的作用，对肿瘤是否有抗肿瘤作用尚未可知。本研究阐明了苯烯莫德对非小细胞肺癌A549 细胞增殖和凋亡的影响，并对其作用机制作进一步探讨。

1 材料与方法

1.1 试剂

苯烯莫德（Tapinarof，CAS：79338-84-4）购于中国上海MedChemExpress 公司；RPMI-1640 培养基，胰蛋白酶（含EDTA 和酚红）购于美国Gibco 公司；胎牛血清购于南美Ex Cell Biologic 公司；青霉素-链霉素双抗（100×），CCK-8 试剂购于中国Biosharp 公司；二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）购于中国Solarbio 公司；4%组织细胞固定液，结晶紫试剂，RIPA 裂解液，PMSF（100 mM），Western 一抗稀释液，Western 二抗稀释液，BCA 蛋白定量试剂盒，HRP 生物素标记二抗兔抗购于中国上海碧云天公司；PAGE 凝胶快速制备试剂盒购于上海雅酶生物公司；PVDF 转印膜（0.22 μm）购于美国Millipore 公司；兔源性一抗GAPDH、β-actin、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、CDK2 和P21 购于美国Cell Signaling Technology 公司；AnnexinV-FITC 细胞凋亡试剂盒，细胞周期试剂盒购于中国杭州联科生物公司；逆转录试剂盒Hifair®Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （gDNA digester plus）购于上海翊圣生物；荧光定量PCR 试剂盒购于中国Biosharp 公司；人源非小细胞肺癌A549 细胞株（美国菌种保藏中心）。

1.2 细胞培养

人非小细胞癌细胞A549 细胞用含10% 胎牛血清、1% 青霉素-链霉素双抗的DMEM 完全培养液，放置37 ℃、含5% CO2的培养箱中常规培养，每2～3 d 给细胞换液或传代。

1.3 细胞克隆形成实验

选择状态较好的A549 细胞，消化离心，加完全培养基调细胞悬液浓度为2×103个/mL。在6 孔板中每孔接种900 个细胞，混匀后放回细胞培养箱中培养。待细胞贴壁，用不同浓度（0、2.5、5、10、20、40）μmol/L 的苯烯莫德分别作用A549 细胞，加药后继续培养。用显微镜观察细胞生长成克隆团后（约9 天）弃去上清，PBS 轻洗细胞两次，去除残留培养基，各孔分别加入600 μL 的4%多聚甲醛，固定时间20 min。弃掉固定液，PBS 轻轻润洗一次，各孔分别加入550 μL 的结晶紫溶液，染色时间20 min。漂洗染液后，放入42 ℃干燥箱中烘干。在亮光处拍照保存照片，并分区计细胞克隆数。每组5 个复孔，实验重复3 次。

1.4 CCK-8 实验

选择状态较好的A549 细胞，消化离心，调细胞浓度为5×105个/mL。在96 孔板中每孔接种100 uL 细胞悬液，周围加入PBS，防止细胞板孔中的液体挥发，继续培养过夜或6 h 以上。用8 组浓度（0、5、10、20、40、60、80、100）μmol/L 的苯烯莫德分别处理A549 细胞，继续培养24 h。避光配制含10%CCK-8 试剂的混合液，现配现用。弃去上清含药物的培养液，各孔加入100 μL 混合液放回培养箱继续培养约40 min。设置酶标仪的单波长为450 nm，逐一精准测量并记录各孔OD 值。计算出各组细胞活力。实验重复3 次。细胞活力=［（实验孔-空白孔）/（对照孔-空白孔）］×100%。

1.5 细胞周期实验

选择状态较好的A549 细胞，消化离心，调细胞悬液的浓度为1×106个/mL。6 孔板每孔接种400 μL，后用完全培养基定容至2 mL ，置于培养箱继续培养。用不同浓度（0、5、10、20）μmol/L 的苯烯莫德分别处理A549 细胞，继续培养24 h。消化离心收集细胞，将预冷固定液（PBS∶无水乙醇=4∶3）加入管底细胞中，小心吹散。后放入-20 ℃冰箱固定过夜（可保存一个月再上机）。上机前将固定细胞离心，弃掉上层固定液。加2 mL PBS 再次水化细胞，离心弃上清。加入300 μL DNA staining solution，吹匀，4 ℃避光孵育半小时，上流式细胞仪检测。

1.6 细胞凋亡实验

选择状态较好的A549 细胞，消化离心，调细胞悬液的浓度为1×106个/mL。6 孔板每孔接种300 μL，后用完全培养基定容至2 mL，置培养箱培养过夜或6 h 以上。用不同浓度（0、10、20、40）μmol/L的苯烯莫德分别处理A549 细胞，继续培养48 h。消化离心收集细胞。设离心机转速为800 r/min，离心5 min，弃上清收集沉淀。使用预冷的PBS 清洗2次。用500 μL 1×结合缓冲液混匀细胞，再每组细胞悬液中分别加入10 μL Annexin V-FITC，8 μL 碘化丙啶（PI）荧光染液，并轻轻混匀。室温避光孵育。5 min 后置流式细胞仪检测。PI 阴性而PITC阳性是早凋细胞（右上象限），双阳性是晚凋细胞（右下象限），凋亡率为两者之和。

1.7 实时荧光定量PCR 实验

1.7.1 细胞RNA 提取和逆转录 选择生长状态较好的细胞，消化离心，铺板。细胞贴壁后加40 μmol/L 的苯烯莫德，继续培养48 h。弃上清，加入PBS 润洗两遍。每孔加1 mL 的Trizol ，轻轻吹打十几次以充分裂解细胞，收集在EP 管中，室温静置5 min。加200 μL 氯仿，震荡，呈粉红色浑浊状后，放于室温2～3 min。后4 ℃ 12 000×g离心15 min。吸水相至新EP 管中。加500 μL 异丙醇，充分摇匀，放于冰上5～10 min。后4 ℃ 12 000×g离心10 min。倒掉上清，RNA 留于管底（肉眼观察可见白色沉淀物）。加入75% 乙醇，轻轻摇动EP 管，使RNA 悬浮。后在4 ℃ 超速离心机中以7 500×g离心5 min。重复两次。室温将乙醇晾干后，加适量DEPC 水。测量RNA 浓度及纯度。储存于-80 ℃冰箱。按照上海翊圣生物逆转录试剂盒说明书操作，获得cDNA，于-20 ℃保存。

1.7.2 荧光定量PCR 实验 引物有上海生工生物合成，GAPDH 上游序列：TCAAGAAGGTGGTGAAGAG，GAPDH 下 游 序 列 ：AGGTGGAAGAATGGGAGTTG；Bcl-2 上游序列：TCGCCCTGTGGATGACTGAGTAC，Bcl-2 下游序列 ：ACAGCCAGGAGAAATCAAACAGAGG；Bax 上 游 序 列 ：AGCGACTGATGTCCCTGTCTCC，Bax 下游序列：AGATGGTGAGTGAGGCGGTGAG；FasL 上游序列：TTCATGGTTCTGGTTGCCTTGGTAG，FasL 上游序列：GCTGTGTGCATCTGGCTGGTAG。配制 20 μL 反应体系，全程避光在冰上操作（设3 个复孔），cDNA 模板按1∶20 稀释，每管样品反应体系加样如下∶SYBR Green qPCR Mix 加10 μL，上下游引物（10 mmol/L）各加0.4 μL，cDNA 模板加2 μL，双蒸水加7.2 μL。加完之后，在涡旋振荡器上震荡20 s混匀，瞬离。放入荧光定量PCR 仪器中，使用三步法反应程序，调相关参数，如下：95 ℃预变性，时间3 min，95 ℃变性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循环40 次，最后根据罗氏仪器推荐程序设置分析溶解曲线。导出每个样品的ct 值，用2-△△ct法计算目的基因相对表达量，归一化后进行统计学分析。

1.8 Western Blot 蛋白免疫印迹

1.8.1 细胞蛋白提取 将6 孔板中上层培养液弃掉，用预冷PBS 润洗细胞两次。加入适量含有1%PMSF 的RIPA 裂解液，每孔约80～120 μL。在冰上裂解2 min。用细胞刮刀顺时针来回刮下细胞，吸取细胞粘液于EP 管中。在冰上放置20～30 min。用4 ℃超速离心机12 000 rpm 离心30 min。吸取上清于EP 管中即得到蛋白溶液。可暂时保存于-80 ℃冰箱。后续实验时取出，再用BCA 蛋白试剂盒测定蛋白浓度。

1.8.2 SDS-PAGE 凝胶电泳 按照PAGE 凝胶试剂盒说明书制备好凝胶，现配现用。将5×蛋白上样缓冲液均匀混入蛋白样品中，稀释成1×蛋白上样缓冲液。100 ℃ 金属浴煮样10 min。变性后可直接进行SDS-PAGE 电泳，或保存在-20℃。根据蛋白表达含量每孔加样20～50 μg。在电泳槽中灌满电泳液。用80 V 恒压，跑浓缩胶30 min。后上调电压至110 V ，跑分离胶1 h。将PVDF 膜切成一定大小，放入甲醇中激活十几秒。后小心夹起泡进预冷的转膜液中。打开转膜夹，黑色面放于底层，依次铺上海绵和滤纸，把切好的凝胶转移到滤纸上，再小心夹起PVDF 膜（不能有折痕），铺在凝胶表面，用剥胶板小心去除气泡，最后再依次铺上滤纸和海绵，夹好转膜夹，放入转膜槽。转膜夹黑色的一面朝向负极，白色的一面朝向正极。泡沫箱底部铺入薄冰，后放入转膜槽，再把预冷的1×转膜液倒入槽内。盖好盖子，用冰块把泡沫箱填满，调恒流200 mA，转膜2 h。转膜结束后，打开转膜夹，用镊子夹出PVDF 膜，并作标记。室温封闭1～2 h。封闭结束后，做相应标记，4 ℃ 冰箱过夜孵育一抗。敷完一抗后，用1×TBST 震荡洗膜3 次，10 min 一次。将PVDF 膜置于按照1∶4 000 配制的二抗中，室温孵育二抗1 ～2 h。敷完二抗后，用1×TBST 震荡洗膜3 次，10 min 一次。在避光条件下，将PVDF 膜放入配制好的显影液中（ECL A 液：B 液=1∶1），用移液枪使膜均匀淋上显影液，用Tanon-5200 曝光仪显出各条带。利用Image j 软件分析出各样本灰度值。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 苯烯莫德抑制非小细胞肺癌细胞增殖

苯烯莫德化学结构式如图1A。用不同浓度的苯烯莫德分别处理A549 和H1299 细胞系约8 d。克隆形成结果显示，A549 和H1299 两种细胞形成的克隆数均显著受到抑制（P＜0.01）。且随着苯烯莫德的浓度逐渐增大，抑制作用越明显，呈浓度依赖性，如图1B-D 所示。CCK-8 结果显示不同浓度苯烯莫德作用A549 和H1299 细胞24 h 后，显著抑制的细胞活力（P＜0.01），并呈浓度依赖性。其中高浓度的苯烯莫德对A549 细胞活性抑制作用更明显（P＜0.01），如图1E-F。

图1 苯烯莫德抑制非小细胞肺癌细胞增殖Fig 1 Tapinarof inhibits the proliferation of non-small cell lung cancer cells

2.2 苯烯莫德诱导A549 细胞凋亡

用不同浓度（0、10、20、40）μmol/L 的苯烯莫德处理A549 细胞48 h，采用Annexin V-FITC 双染法流式细胞仪分析细胞的凋亡率，结果如图2A 所示。分析结果发现，与对照组（0 μmol/L）相比，20、40 μmol/L 浓度的苯烯莫德处理A549 细胞，细胞凋亡率逐渐增加（P＜0.01），并呈浓度依赖性，如图2B所示。

图2 苯烯莫德诱导A549 细胞凋亡Fig 2 Tapinarof induces apoptosis of A549 cells

2.3 苯烯莫德调控A549 细胞凋亡相关蛋白及基因mRNA 表达

用不同浓度（0、10、20、40 μmol/L）的苯烯莫德处理A549 细胞48 h，结果发现，与0 μmol/L 组相比，20 和40 μmol/L 浓度的苯烯莫德显著上调cleaved-caspase 3 和cleaved-PARP 的表达量（P＜0.01），并呈剂量依赖性，如图3A-C 所示。荧光定量PCR 实验结果显示，与0 μmol/L 组相比，40 μmol/L浓度苯烯莫德处理组降低了抗凋亡基因Bcl-2 mRNA 的表达，同时增加了促凋亡基因Bax、Bad 和Fasl mRNA 的表达（P＜0.01），如图3D 所示。

图3 苯烯莫德调控A549 细胞凋亡相关蛋白及基因mRNA 表达Fig 3 Tapinarof regulates the expression of apoptosis related proteins and genes in A549 cells

2.4 苯烯莫德诱导A549 细胞阻滞在G1 期

用不同浓度（0，5，10，20）μmol/L 的苯烯莫德作用A549 细胞24 h，结果发现，0 μmol/L 组G1 期细胞比率为61.2%，10 μM 组G1 期细胞比率为66.88%，20 μmol/L 组G1 期细胞比率为75.72%，如图4A 所示。经统计学分析，相比0 μmol/L 组，10 μmol/L 和20 μmol/L 组的G1 期细胞比率显著升高（P＜0.01），S 期和G2 期细胞比率均有所下降，如图4B 所示。这些结果说明苯烯莫德会诱导A549细胞系阻滞在G1 期。不同浓度苯烯莫德作用于A549 细胞24 h 后，用Western Blot 实验检测了周期相关蛋白P21 和CDK2 蛋白的表达变化，结果发现苯烯莫德可以上调P21 蛋白而下调CDK2 蛋白的表达（P＜0.01）。如图5A～C。

图4 苯烯莫德诱导A549 细胞周期阻滞Fig 4 Tapinarof induces cell cycle arrest in A549

图5 细胞周期G1期相关蛋白P21 和CDK2 蛋白的表达Fig 5 Expression of P21 and CDK2 proteins associated with G1 phase of the cell cycle

2.5 苯烯莫德抑制A549 细胞中AKT 的磷酸化水平而增加FOXO1 水平

AKT 在细胞增殖中发挥着重要作用，因此采用Western Blot 检测总AKT、p-AKT 和FOXO1 蛋白的表达，结果显示与0 μmol/L 组相比，苯烯莫德降低A549 细胞p-AKT 的表达（P＜0.01），增加FOXO1 蛋白表达（P＜0.01），而总AKT 无明显变化，如图6A～C 所示。

图6 苯烯莫德对p-AKT 和FOXO1 蛋白表达的影响Fig 6 Effects of tapinarof on expression of p-AKT and FOXO1 protein

3 讨论

本研究发现，苯烯莫德能明显抑制NSCLC 细胞克隆形成和细胞活力，诱导细胞周期G1 期阻滞，并促进凋亡。苯烯莫德作用NSCLC 细胞后，cleaved-caspase 3 和cleaved-PARP 蛋白表达上调，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA 表达下降而促凋亡基因Bax、Bad、FasL mRNA 表达增加。在细胞周期时相进程方面，苯烯莫德诱导细胞周期阻滞在G1 期，并上调P21 蛋白的表达而抑制CDK2 蛋白的表达。在进一步的机制研究中，Western Blot 结果显示p-AKT 表达下降，而FOXO1 表达增加，因此苯烯莫德的抗肿瘤作用可能与AKT/FOXO1 信号通路有关。这些结果表明苯烯莫德对A549 细胞有抗肿瘤作用。

苯烯莫德是一种小分子AhR 激动剂，可特异性结合并激活AhR［15］。已有研究表明，在体内外研究中，苯烯莫德可直接结合并激活多种细胞类型，促进细胞内的CYP1A1 和CYP1B1 等多种与新陈代谢相关基因的表达，并诱导AhR 的核易位［12］。然而其在肿瘤治疗方面是否具有抗肿瘤作用尚未有研究报道。在本研究中发现苯烯莫德可以显著抑制NSCLC 细胞的增殖并诱导凋亡，这对苯烯莫德药物用于抗肿瘤具有重大意义。

Caspase 级联信号在内外源性细胞凋亡中发挥重要作用。在其成员中，caspase 3 在启动细胞凋亡中起着不可替代的作用，其催化的高度激活是细胞凋亡导致细胞死亡的常见引发剂。PARP 在体内主要被caspase 3 裂解，是检测DNA 损伤的关键酶，所以PARP 的裂解产物也被认为是细胞凋亡的一个生物学标志。有研究表明天然产物曲拉林通过激活caspase 3 和PARP 有效诱导胃癌细胞的凋亡。在本研究中发现，Tapinaorf 作用A549 细胞后，cleaved-caspase 3 蛋白和cleaved-PARP 蛋白表达明显上调。Bcl-2、Bcl-xl 、Bax 和Bad 是Bcl-2 家族的重要成员，主要介导内源性细胞凋亡（线粒体依赖性），它们之间的平衡调控着细胞凋亡。Bax 与Bcl-2 比值的增加，会使线粒体释放细胞色素c，进而裂解caspase 3 和 RARP ，导致细胞发生凋亡［16］。有研究证实在卵母细胞中，多环芳烃7，12-二甲基苯［a］蒽可以靶向AhR 上调促凋亡分子Bax 的表达，导致卵母细胞凋亡［17］。另一方面，Fas/FasL 在外源性细胞凋亡中起关键作用，当死亡受体被外在因素刺激时，二者结合激活caspase 8 和caspase 3，活化的caspase 3 切割蛋白质，使细胞发生凋亡［18］。在本研究中，通过荧光定量PCR 实验发现A549 细胞经苯烯莫德作用后，促凋亡基因Bax、Bad 和FasL mRNA 水平上调，而抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平下调。这些结果表明苯烯莫德可以通过内在和外在途径诱导非小细胞肺癌细胞的凋亡，进而抑制细胞增殖。

许多化合物治疗肿瘤的策略侧重于诱导细胞周期的阻滞［19，20］。细胞周期有四个不同阶段，包括G1、S、G2 和M 期，通常由几种周期蛋白依赖性激酶（CDK）调节［21］。G1/S 期细胞周期的转变主要由cyclinD-CDK4/6（早期）和cyclinE-CDK2（晚期）两种周期蛋白/CDK 复合物调控，已有研究表明，其通过促进RB（视网膜细胞瘤）磷酸化调控细胞周期［22］。P21 蛋白可以抑制CDK2 蛋白的表达，是G1/S 期转变的负调控因子，诱导细胞阻滞在G1期。有研究证实，桑葚素和抗精神药物佛罗林肝癌HepG7 和Huh1 细胞中上调 P21 蛋白表达而抑制CDK2 的表达，使细胞周期阻滞在G1 期［23，24］。在本研究中也显示，苯烯莫德增加了P21 蛋白的表达而抑制CDK2 的表达，促使非小细胞肺癌细胞阻滞在G1 期。

AKT 在肿瘤细胞中发挥重要作用，参与细胞生存、增殖、凋亡等过程。磷酸化AKT（p-AKT）参与细胞增殖、凋亡和转移的调控［25］。过表达p-AKT被认为是治疗肿瘤一个靶点。例如，已有报道显示p-AKT 的高表达与乳腺癌、状甲状腺癌和结直肠癌患者的癌转移呈正相关［26］。也有研究表明，脂联素激活AKT 信号通路防止心肌细胞凋亡来保护心肌，姜黄素可以通过降低p-AKT 表达来抑制胶质母细胞瘤细胞的生长［27，28］。在本研究中发现苯烯莫德对总AKT 的表达无明显影响，而降低了p-AKT 的活性，表明其对NSCLC 的抗肿瘤活性与p-AKT 的活化有关。在癌症的细胞周期中，FOXO1 信号可以靶向 P21 蛋白抑制细胞增殖［29］。有研究表明，在前列腺癌PC3 和LNCaP 细胞中过表达FOXO1，细胞增殖能力降低［30］。在本研究中，苯烯莫德作用非小细胞肺癌细胞后，p-AKT 的表达减少，FOXO1 表达增加，表明苯烯莫德抑制非小细胞肺癌细胞的增殖并诱导凋亡可能依赖AKT/FOXO1 信号通路。

综上结果所示，本研究发现苯烯莫德可以抑制非小细胞肺癌A549 和H1299 细胞增殖，诱导G1 期阻滞和凋亡；其作用机制可能与AKT/FOXO1 信号通路有关；揭示了苯烯莫德可能是抗肿瘤的潜在药物，但本研究尚未阐明其具体的作用方式和机制，后续需进一步研究。

作者贡献度说明：

高二可：完成实验，分析数据，撰写论文，文献收集分析；钱峰：研究指导，论文修改；金齐力：论文撰写指导

所有作者声明不存在利益冲突关系。