miR-483-5p 靶向Timp2 调控破骨细胞的生成

牛田琦，刘彩霞，熊 军，贾 浩，王 华，李 霜，邓慧鸣，曾祥周

（海南医学院，海南 海口 571199）

破骨细胞（osteoclasts，OCs）是来自单核-巨噬细胞谱系的多核骨吸收细胞［1］，破骨细胞作为人体内唯一负责骨吸收的细胞类型，对正常骨骼发育和体内骨平衡至关重要，过度激活会导致骨内环境平衡失调［2］，进而导致多种溶骨性骨疾病，如骨质疏松症、骨佩吉特病和侵蚀性关节炎［3］。因此，破骨细胞已成为预防和治疗骨溶解疾病的重要靶点。microRNA 是一类高度保守的单链小分子非编码RNA，在真核生物中可调节超过30% 的基因［4］。miRNA 可特异性结合靶标的3'-非翻译区（3'-UTR），通过干扰mRNA 的稳定性和/或阻断蛋白翻译抑制mRNA 的表达［5］。大量研究表明，miRNA通过调控上述多种因子和激素影响各信号通路，导致OCs 分化和功能改变［6-8］。miR-483 是Landgraf等［9］于2007 年报道的在人胎肝中发现的一种miRNA，经酶切后形成miR-483-5p 和miR-483-3p。关于miR-483-5p 的大多数文献与肿瘤有关。但是，目前关于miR-483-5p 通过Timp2调控OCs 生成及其机制未见报道。前期研究通过生物信息软件发现了miR-483-5p 的靶基因Timp2，并对比了二者部分基因序列，发现有互补序列，进而通过体外荧光素酶分析验证靶点，并利用RANKL 诱导RAW264.7细胞向OCs 分化体系进行靶向验证，明确miR-483-5p 靶向于Timp2影响OCs 分化及活性的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

RAW264.7 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞和人胚肾293T 细胞均购自中国科学院细胞库。

主要试剂和仪器：GP-transfect-Mate 转染试剂来自苏州吉玛基因有限公司；荧光素酶报告基因检测试剂盒来自安诺伦北京生物科技有限公司；Lipo 2000 转染试剂来自美国赛默飞公司；白细胞酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒来自美国Sigma 公司；蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒均来自上海碧云天生物技术有限公司；反转录试剂盒Prime Script TM RT Master Mix （Perfect Real Time）、荧光定量检测试剂盒TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）均来自日本TaKaRa 公司；TRIzol 试剂来自美国Invitrogen 公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 培养基、青霉素和链霉素均来自美国Gibco 公司；多功能酶标仪（型号：Synergy HTX）来自美国Biotek 公司；实时荧光定量PCR 仪（型号：Roche LightCycler480Ⅱ）来自德国罗氏诊断公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息软件预测 用TargetScan8.0 数据库网站https：//www.targetscan.org/vert_80/预测可能与miR-483-5p 靶向的靶基因，对所预测靶基因和miR-483-5p 的基因序列进行对比，寻找是否有互补序列。

1.2.2 双荧光素酶活性检测 构建Timp2野生型和突变型3'-UTR 质粒来自于苏州吉玛基因股份有限公司。转染：293T 细胞按5×105细胞/孔的浓度接种12 孔板，各组分别设置3 个复孔，用含10%FBS、100 U/mL 青霉素G 和100 μg/mL 链霉素的DMEM 培养基于37 ℃、5% CO2培养24 h，使细胞完全贴壁。转染分组为：mimic NC +Timp2野生、miR483 mimic+Timp2野生、mimic NC+Timp2-miR483-突变、miR483 mimic+Timp2-miR483 突变。参照GP-transfect-Mate 说明书进行转染，在培养箱中温育5 h 后弃掉旧转染液，加入500 μL 含10% FBS 的DMEM 培养液。37 ℃ 5%CO2继续培养48 h。双荧光素酶系统检测：弃掉12 孔板中的培养液，用500 μL PBS 洗涤细胞两次，将1×PLB 300 μL 加入到培养孔中，在室温轻缓晃动培养板15 min，把裂解液转移到检测试板中，每孔100 μL。用Synergy HTX 酶标仪双荧光素酶检测系统分别检测萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，选择1～2 s 延迟，5～10 读数。

1.2.3 细胞转染 将miR-483-5p mimic、miR-483-5p inhibitor 和Timp2siRNA 分别转染入RAW264.7细胞中用于后续实验。转染方法：取RAW264.7 细胞按5×104/孔密度铺板于24 孔板，用含10% FBS、100 U/mL 青霉素G 和100 μg/mL 链霉素的DMEM 培养基500 μL/孔培养24 h，使细胞完全贴壁。参照Lipo 2000 说明书进行转染。37 ℃、5%CO2培养箱培养5 h 后，弃掉板中的旧转染液，加入含10% FBS 的DMEM 培养基500 μL/孔，除Blank组外，其余各组加入终浓度为100 ng/mL 的RANKL，继续培养。

1.2.4 共转染实验 首先将来自于苏州吉玛基因公司构建的慢病毒Timp2-LV 根据说明书感染入RAW264.7 细胞，待细胞在6 孔板中培养至90%以上，消化后重新以5×104/孔密度铺板于24 孔板，进行后续转染miR-483-5p mimic 实验。

1.2.5 Western blot 检测 RAW264.7 细胞转染后培养2 d 后用含PMSF 的RIPA 缓冲液从培养的细胞中提取全细胞蛋白。全细胞蛋白浓度用BCA 蛋白测定试剂盒测定。等量的全细胞提取物通过10% SDS-PAGE 和电泳分离，转移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脱脂牛奶在TBST 中阻断1 h 后，用Timp2和β-actin 一抗在4 ℃下孵育过夜，然后用HRP 耦联二抗孵育1 h，最后用蛋白显影仪用ECL试剂检测条带。用ImageJ 软件对western blotting得到的信号进行量化。用β-actin 进行归一化。

1.2.6 TRAP 染色 RAW264.7 细胞转染后培养4 d 后行TRAP 染色，具体实验步骤按照试剂盒说明书进行。在倒置显微镜下观察拍照，视野中观察到的紫红色部分为OCs 的胞浆，胞浆中蓝染部分为OCs 的胞核，并按TRAP 染色阳性且细胞核数大于3 个的为破骨细胞进行计数。

1.2.7 RT-PCR 检测 RAW264.7 细胞转染后培养2 d 后用TRIzol 试剂从培养的RAW264.7 细胞中分离总RNA。利用逆转录试剂盒Prime Script TM RT Master Mix（Perfect Real Time）将500 ng 总RNA 反转录合成cDNA。实时PCR 根据TB Green®Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒说明书配制反应体系，用Roche LightCycler480实时荧光定量PCR 仪进行扩增反应，扩增参数如下：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，共40 个循环。实验小鼠引物序列如下：TRAP 上游引物：5'-GTGGAAGCCTCTGGAAAATC-3'，下游引物：5'-CTCCTCCCTCACACCCGTTA - 3'；NFATc1 上游引物：5'-CCGTTGCTTCCAGAAAATAACA-3'，下游引物：5'-TGTGGGATGTGAAACTCG GAA - 3'；Cathepsin K 上游引物：5' - CTTCCAATACGTGCAGCAGA-3'，下 游 引 物 ：5'-TCTTCAGG GCTTTCTCGTTC-3'；MMP-9上游引物：5'-CAAAGACCTGAAAACCTCCAA-3'；下游引物：5'-GGTACAAGTATGCCTCTGCCA-3'；β-actin 上游引物：5'-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3'；下游引物：5'-TGATGTCACGCACGATTT-3'。采用2-ΔΔCT法评估相关基因表达，所有值用β-actin 归一化。

1.3 统计学处理

采用SPSS26.0 软件对数据进行统计分析。计量资料间的分析采用单因素方差分析和LSD 事后检验进行统计学意义分析。P＜0.05 判断差异为具有统计学意义。

2 结果

2.1 靶基因预测

通过Target Scan 8.0 软件预测mmu-miR-483-5p 的靶基因，并通过接下来的荧光素酶报告基因发现Timp2可能是miR-483-5p 影响OCs 分化的靶点，并对Timp2进行接下来的验证。

2.2 荧光素酶报告基因检测验证Timp2 是否为mmu-miR-483-5p 靶点

通过对Timp2的3'-UTR 与mmu-miR-483-5p的互补区对比发现完全互补，见图1（A）。为了验证Timp2与mmu-miR-483-5p 的靶向关系，成功克隆了Timp23'-UTR，构建了用于miRNA 靶标检测的野生型Timp2WT 以及突变型Timp2MUT 重组载体。双荧光素酶报告基因检测系统发现，转染HEK 293T 细胞2 d 后，共转染野生型重组载体Timp2WT 时，与 mimics NC 组比较，mmu-miR-483-5p mimics 组的荧光活性显著下调（F=19.401，P＜0.05），见图1（B）；而共转染突变型重组载体Timp2MUT 时，mimics NC 组与mmu-miR-483-5p mimics组的荧光素酶活性差异不显著（F=0.05，P＞0.05），见图1（C）。说明mmu-miR-483-5p 可以与预测的Timp2基因的3'-UTR 位点互补，两者之间存在靶向调控关系。上述结果初步提示Timp2基因可能是mmu-miR-483-5p 调控破骨细胞生成的靶基因。

图1 双荧光素酶报告分析Fig 1 Luciferase reporter assays

2.3 转染miR-483-5p 在RAW264.7 细胞中的含量对Timp2 的影响

将miR-483-5p mimic 和miR-483-5p inhibitor 分别转染入RAW264.7 细胞后发现，增加细胞中miR-483-5p 的表达后相较于NC 组，Timp2的蛋白含量显著降低（F=13.218，P＜0.05），相反，抑制miR-483-5p 的表达后相较于inNC 组，Timp2的蛋白含量有所提高（F=25.693，P＜0.01），见图2，这说明在体外miR-483-5p 至少与Timp2蛋白有靶向关联，且呈负相关。

图2 Western blot 检测Fig 2 Western blot analysis

2.4 沉默RAW264.7 细胞中Timp2 对OCs 分化的影响

为明确Timp2与OCs 之间的关系，本研究用Timp2的siRNA 沉默RAW264.7 细胞中的Timp2，诱导OCs 后TRAP 染色显示，相较于RANKL 诱导的阳性对照组，沉默细胞中Timp2会导致更多OCs生成（F=118.021，P＜0.05），见图3（A）。而RTPCR 结果与之对应，各特异性基因TRAP（F=7 358.715，P＜0.05）、NFATc1（F=1 741.066，P＜0.05）、Cathepsin K（F=239.981，P＜0.05）和MMP-9（F=4 456.654，P＜0.05）的表达相应增高，见图3（B），这提示在RAW264.7 细胞中Timp2作为miR-483-5p 的靶点可影响OCs 分化及活性。

图3 TRAP 染色和RT-PCR 检测Fig 3 TRAP staining and RT-PCR analysis

2.5 miR-483-5p 和Timp2 共处理RAW264.7 细胞后对OCs 分化的影响

Timp2- LV 和miR - 483 - 5p mimic 共处理RAW264.7 细胞后TRAP 染色结果显示，与RANKL 组相比，仅转染miR-483-5p mimic 可促进OCs 分化，并且分化出的OCs 体积增大，但在转染miR-483-5p mimic 的前提下，过表达Timp2可显著逆转miR-483-5p mimic 引起的过度OCs 活化（F=108.721，P＜0.05），见图4（A）。RT-PCR 检测特异性基因得到了和TRAP 染色一致的结果（TRAP：F=323.829，P＜0.05；NFATc1：F=197.148，P＜0.05；Cathepsin K：F=431.888，P＜0.05；MMP-9：F=448.821，P＜0.05），见图4（B）。因此miR-483-5p和Timp2在体外呈靶向且相互拮抗的作用，miR-483-5p 可通过降低Timp2的表达导致OCs 过度分化。

图4 共转染后TRAP 染色和RT-PCR 检测Fig 4 TRAP staining and RT-PCR analysis after co-transfection

3 讨论

越来越多的研究证明OCs 在病理条件下的形成和激活异常对多种疾病中的骨破坏的影响非常关键［10］。OCs 分化过程受到多种因子和激素的影响，包括RANKL、M-CSF、性激素等，这些因素作为信号分子导致下游多条信号通路被激活，如NFATc1（主要）、MAPK、MITF、PI3K/AKT 和NF-κB 等，从而调节OCs 的分化和活性［11，12］。除了这些促破骨因子外，还有一些发挥抑制作用的调节因子，如骨保护素（OPG）与RANKL 的可溶结合，导致RANK/RANKL 信号通路的激活被沉默。而雌激素可通过刺激OPG 的产生间接地抑制骨吸收［13］。此外，一些促炎细胞因子也可促进OCs 的形成［14］。

许多研究认为在OCs 形成过程中，干预调控破骨相关的miRNA 具有重要意义。自1993 年发现了第一个名为“lin4”的miRNA 以来，越来越多的研究在多种有机体中发现了许多miRNA 可以通过负向调控多个基因的表达来控制多种生物过程，包括器官发生、发育、造血功能、细胞凋亡、增殖和肿瘤发生等，是控制细胞增殖、迁移和细胞分化等过程的关键调控分子［15］，miRNA 来自RNA 聚合酶Ⅱ，该转录序列来自于非编码DNA 序列、内含子或非翻译区（UTR）内的编码序列［16］，其调控基因的功能作用于转录后水平［17］，许多miRNA 已被确定为淋巴细胞和巨噬细胞的关键调节因子（如miR146a 或miR155）［18］。

在针对miR-483-5p 的研究中，Wang 等［19］报道了miR-483-5p 可通过调节软骨细胞肥大参与骨关节炎的发生、发展；De-Ugarte 等［20］通过miRNA 芯片分析发现骨质疏松病人来源的松质骨样本中miR-483-5p 的表达水平较对照组明显上调。

有研究表明miR-483-5p 有助于单核细胞分化为OCs［21］，而在本研究中，首先利用生物信息软件预测miR-483-5p 可能与Timp2有靶向关系，进而构建Timp23'-UTR 的野生型（WT）和突变型（MUT）双荧光素酶报告基因载体，通过RT-PCR 检测和基因测序确定Timp2是miR-483-5p 的靶点。随后，利用miR-483-5p mimic 和miR-483-5p inhibitor 人为的上调或下调RAW264.7 细胞中miR-483-5p 的含量后对靶蛋白进行检测，体现出miR-483-5p 可影响RAW264.7 细胞中Timp2的蛋白表达量。并研究了Timp2在OCs 分化过程中的作用，结合两部分数据，笔者认为miR-483-5p 可通过靶向Timp2调控OCs 的分化过程及其破骨活性。对RAW264.7 细胞的共处理验证了该猜想，在RAW264.7 细胞分化为OCs 过程中，Timp2可显著逆转miR-483-5p 带来的OCs 过度活化。因此，通过以上体外实验验证了miR-483-5p 通过调控Timp2影响OCs 分化和活性。这一发现对干预调控破骨相关的miRNA 影响OCs形成具有重要意义，为治疗OCs 过度分化导致的骨破坏疾病提供了新的潜在思路和策略。

作者贡献度说明：

曾祥周：项目主持人，负责实验设计、实验指导及论文修改指正；牛田琦：负责实验实施、数据处理及论文撰写；刘彩霞：负责部分数据处理；熊军、李霜、邓慧鸣：负责样本收集整理；王华、贾浩：负责针对靶基因预测提供技术指导。

所有作者声明不存在利益冲突关系。