续断种子方对少精子症模型小鼠附睾结构改变的干预

刘金尧，何 明，王权胜，唐振宇，杨德芬

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.桂林市中医医院，广西 桂林 541002；3.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁530023）

数据统计显示，65%以上男性不育的病因及其相关发病机制尚未被发现。2017 年欧洲泌尿外科学会相关资料表明，少精子类型所导致的男性不育患者比例不断上涨［1］。而由于男性因素所致的不育约占50%，少精子症的患者至少有5 000 万［2］。少精子症作为男性不育症病型之一，由多方面因素所致：生精功能、附睾功能异常，输精管梗阻，遗传及生活环境等因素［3，4］，其中附睾结构及其微环境的改变是导致少精子症的重要原因之一［5］。精子从精原细胞发育到成熟精子经历了复杂的过程，附睾是精子成熟和储存的重要场所。目前中药方对附睾少精子症研究很少报道。本课题组经过对实际临床经验的总结，认为男性不育症多缘于“营气不从，肾精亏虚”，治疗较多以续断种子方，相关的实验研究表明治疗确有成效［6］。该实验拟创设实验性少精子症小鼠模型，通过观察小鼠附睾结构局部显微、超微结构，研究续断种子方对少精子症模型小鼠附睾结构的干预作用，为精子发育成熟提供培育场所。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

MACRO 精子计数板和WLJY-9000 型伟力彩色精子质量检测系统（北京伟力新世纪科技发展有限公司）；TDL-4ZB 型低速自动平衡离心机（湖南星科科学仪器有限公司）；电子光学显微镜，广西中医药大学第一附属医院病理科提供。

1.2 实验试剂

白消安针剂，批号：K1625007，购自阿拉丁公司；TUNE 试剂盒，产品号：11684817910，北京中杉金桥生物技术有限公司；α-葡糖苷酶检测试剂盒，南京欣迪生物药业工程有限公司，批号：A10740102。

1.3 实验动物

45 只6～8 周龄，重24～28 g 的雄性小鼠，购于广西医科大学实验动物中心，动物许可证号［SCXK（桂）2009-0002］。全部小鼠分笼喂养，在20～25 ℃温度下适应性饲养7 d，各自进水进食。3 d 更换干燥垫料。本实验通过广西中医药大学动物伦理委员会批准。

1.4 动物模型制作及分组

实验小鼠饲养7 d 后，无异常活动，制备少精子症小鼠模型，方法依照文献［7］：除外正常组10 只小鼠，余下小鼠选取白消安（Sigma 产品）配以5 mL 0.9%生理盐水，经腹注射白消安（10 mg/kg），连续5 d，正常组注射相同数量生理盐水，在35 只小鼠中选取5 只处死开腹摘取小鼠附睾，光学显微镜下观察附睾见少量精子，说明成功造模少精子症小鼠模型。余下30 只小鼠按随机数字表法分为模型组、左卡尼汀组（左卡组）、续断种子方组（续断组）各10 只。

1.5 实验药物

1.5.1 续断种子方组 药物包括（女贞子、山药、骨碎补、菟丝子、红藤、牛膝、杜仲、党参、白术、淫羊藿、枸杞子、续断各10 g），单味中药颗粒（免煎中药，江苏省江阴市天江药业有限公司生产，产品批号1203002）。

1.5.2 左卡尼汀组 左卡尼汀口服液（沈阳第一制药有限公司，国药准字H19990372）。

1.6 方法

1.6.1 干预方法 造模成功后，采用药物灌胃干预治疗。0.9%生理盐水灌胃（模型组和正常组）；续断组予9 g·kg-1·d-1的续断种子方配以生理盐水；左卡组予75 mg·kg-1·d-1的左卡尼汀口服液配以生理盐水；1次/d，连续8 周。

1.6.2 取材方法 末次灌胃结束24 h 后，头颈部处死小鼠，切除其腹部附睾，取下各组一侧附睾相关组织，迅速放置Bouin 溶液中固定，固定后乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡切片包埋，苏木素-伊红（HE）染色，做附睾组织HE 染色检测和电镜备检用。在添加2 mL 培养液的容器中使用眼科剪剪碎另一侧附睾，精子充分游离泳动（36.5 ℃，30 min），做精液分析和精浆生化备检用。

1.6.3 精液全自动检测 采取精子计数板和精子检验系统进行精子浓度和活动力的测定，精子部分参数依照WHO《人类精液检查与处理实验室检验手册》［8］标准测定。

1.6.4 精浆生化指标检测 采用3 000×g离心液化后的精液10 min，-20 ℃环境下放置精浆备检。以α-葡糖苷酶检测试剂盒测定精浆NAG 活性；选用间苯二酚比色法测定精浆果糖浓度。

1.6.5 HE 染色法检测 采用HE 染色各组10 张附睾组织切片，各切片观察2 个视野。在附睾头部和尾部使用具有圆形形状（×200 倍）的附睾小管的15个横切面进行上皮高度评价。测定附睾头部和尾部的管状（上皮，管腔间隔和平滑细胞）比例，每只动物随机捕获10 个图像（×200）。将包含100 个交叉点的网格叠加在图像上，并将这些点分类为：上皮，管腔，平滑肌和间质，每只动物共有1 000 个交叉点，计算每个组体积比例。通过光学显微镜测量头部和尾部中附睾小管的直径和上皮厚度。附睾小管的直径由纵向和横向横截面的平均值确定。

1.6.6 超微结构检测 选取各组合适附睾组织，置放1%多聚甲醛和2%戊二醛混合液之中，在电镜下可见附睾相关组织变化，视野中可见附睾上皮、线粒体、内质网以及附睾管等亚细胞结构。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 造模后小鼠相关表现

各组小鼠的饮水和进食较前均有减少，精神欠佳，自主活动减少，体重减轻，毛发脱落，反应不灵敏等表现，予药物灌胃1 周后上述症状逐渐好转。期间因灌胃剂量不准确导致2 只小鼠死亡（模型组、左卡组各1 只），因药物灌胃操作不当导致刺破部分脏器等因素导致2 只小鼠死亡（续断组、模型组各1只）。

2.2 附睾精子质量、α-葡糖苷酶、果糖、SOD 影响

与正常组比较，模型组小鼠精液浓度、活力、超氧化物歧化酶（SOD）、α-葡糖苷酶、果糖显著下降差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，续断组精液浓度、活力、SOD、α-葡糖苷酶、果糖、SOD 显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与左卡组比较，续断组精液浓度、活力、果糖显著增加（P＜0.05），α-葡糖苷酶、SOD 显著增加差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 附睾精子质量、α-葡糖苷酶、果糖、SOD 影响（±s）Tab 1 Effects on epididymal sperm quality，A-glucosidase，fructose and SOD （±s）

表1 附睾精子质量、α-葡糖苷酶、果糖、SOD 影响（±s）Tab 1 Effects on epididymal sperm quality，A-glucosidase，fructose and SOD （±s）

注：与模型组比较,**P＜0.01;与左卡尼汀组比,#P＜0.05，##P＜0.01。

组别正常组模型组左卡组续断组SOD(nmoL/mg)106.04±15.69 77.52±21.42 107.32±17.63##118.04±12.18**137.8 0.22 n 10 899 Ft精子浓度（106/mL）47.53±5.28 17.29±4.83 30.05±5.25#34.37±5.08**52.2 0.29活动率（%）61.71±6.03 20.17±6.22 36.10±6.48#41.49±7.53**53.1 0.21 α-葡糖苷酶(mU/g)16.51±3.42 10.56±2.62 14.45±5.24##13.81±4.57**22.7 0.18果糖(mg/mL)111.81±4.47 83.23±13.22 114.32±12.08#106.53±12.65**48.9 0.56

2.3 对附睾管上皮高度及比例、管室间隔、平滑肌的影响

与正常组比较，模型组上皮高度及比例、平滑肌比例、管间隔显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组，续断组上皮高度及比例、平滑肌比例、管间隔显著下降差异具有统计学意义（P＜0.01）；与左卡组比较，续断组上皮比例降低（P＜0.05），平滑肌比例、管间隔显著降低（P＜0.01），差异具有统计学意义。见表2。

表2 对附睾管上皮高度及比例、管室间隔、平滑肌的影响（±s）Tab 2 Effects on height and proportion of epididymal tube epithelium，interventricular septum and smooth muscle（±s）

表2 对附睾管上皮高度及比例、管室间隔、平滑肌的影响（±s）Tab 2 Effects on height and proportion of epididymal tube epithelium，interventricular septum and smooth muscle（±s）

注：与模型组比较,**P＜0.01；与左卡组比较,#P＜0.05，##P＜0.01。

平滑肌比例（%）3.71±0.25 6.19±0.50 4.70±0.24##4.59±0.27**5.8 0.33组别正常组模型组左卡组续断组n 10 899 Ft上皮高度23.94±2.47 28.97±2.19 23.54±2.52 24.12±2.55**31.2 0.28上皮比例20.39±0.68 29.53±2.01 21.90±0.94#17.80±0.43**19.3 0.86管间隔（%）18.31±4.80 29.16±2.96 31.23±2.86##28.23±8.33**21.8 0.52

2.4 对小鼠附睾结构的影响

光镜观察下可见，正常组小鼠附睾相关组织完整，管腔内精子分布均匀，正常纤维、小血管等相关组织结构存在附睾间质内（图1A）。模型组附睾管腔内可见较多脱落的生殖细胞，精子减少，部分精子变性，融合聚集；附睾管上皮细胞增大，上皮内晕细胞和亮细胞数目显著增多，其附睾管间可见炎细胞及纤维组织增生性变化。附睾间质水肿，管腔内含少量精子残余体、未成熟生精细胞、畸形精子等（图1B）。续断组：仅附睾头管腔可见单个脱落的生殖细胞，其余2 个附睾组织（附睾体、附睾尾）结构完整，附睾管上皮细胞、基膜细胞、间质细胞、血管内皮细胞完整，管腔内储存大量精子细胞（图1C）。左卡组仅附睾头管腔可见单个脱落的生殖细胞，其余2 个附睾组织（附睾体、附睾尾）结构完整，附睾间质有少许水肿、微小血管扩张、主细胞及基细胞出现空泡化管腔（图1D）。

图1 光镜下各组小鼠附睾相关组织结构改变 （HE×200）Fig 1 Changes of structure of epididymis related tissues in each group under light microscope（HE×200）

2.5 对小鼠附睾超微结构的作用

电镜下，正常对照组小鼠附睾细胞中观察见内质网与高尔基复合体，精子结构完整，鞭毛结构正常；附睾细胞之间的密切联系复合体构成了血睾屏障，在此基础形成了屏障机制（图2A）。模型组小鼠附睾内见错落分布的内质网和高尔基复合体，呈退行性改变的附睾管柱状上皮细胞；结构错杂排列的管腔面胞质大量散落，空泡化的基底部胞质数目明显上涨，部分局部缺失；精子相关结构破坏，显示出大小形状各异的线圈状（图2B）。续断组附睾主细胞中的高尔基复合体内质网、线粒体分布有序，组织形态完整，许多成熟精子存在附睾管腔内（图2C）。左卡组可见分布较整齐的附睾睾管柱状上皮细胞，附睾内质网以及高尔基复合体形态较正常，退变的线粒体得到显著变化，成熟精子和畸形精子相间存在于管腔内（图2D）。

图2 电镜下各组小鼠附睾组织超微结构（EM×3 000）Fig 2 Ultrastructure of epididymis of mice in each group under electron microscope（EM×3 000）

3 讨论

少精子症作为男性不育症的临床常见病型，因其复杂的发病机制及多种病因，也发展为男性不育研究的热点之一。附睾结构和微环镜对精子的发育成熟至关重要，并且附睾也可加速肉毒碱、糖蛋白以及多种酶等的分泌，精子的成熟、运动以及发挥常规生理功能皆与上述物质紧密相关［9］。附睾腔中雄激素含量很高，附睾上皮本身也能分泌少量雄激素，研究表明，睾酮是精子发生必不可少并调制附睾收缩和管腔流体黏度因素之一［10］。附睾结构的破坏可导致少精、弱精及精子畸形。因此，课题组通过建立少精子症模型小鼠，研究续断种子方对模型小鼠附睾管结构和微环境的影响，为精子发育成熟提供培育基地。

单根细长扁平小管高度卷曲组成小鼠附睾，从上至下可分为附睾头、体、尾部3 部分，每个区域节段内有着特殊腔内微环境，这对于睾丸精子到达尾部时成熟是至关重要的。研究表明，头部和体部是提供精子成熟的微环境，尾部区域主要功能存储网状站精子［11］。附睾上皮由不同的细胞类型组成，其中包括主细胞，基底细胞，透明细胞，顶端细胞和晕细胞等细胞，形成围绕内腔的单层［12］。在初始部分，高柱状主细胞负责水的吸收；离子和小有机分子也被吸收。头部中的主细胞参与蛋白质分泌，这些蛋白质吸附在精子膜上并改变其蛋白质组成。体部的主要细胞在其核上区域具有丰富的脂质，这些细胞可能有助于修饰精子质膜的脂质成分。尾部的上皮比头部段短得多，透明细胞很普遍，这些透明细胞吞噬从成熟精子中脱落的细胞质液滴，并且可能还吞噬其他管腔碎片。在尾部，过量的腔蛋白被吸收，而固定蛋白被分泌以保持精子静止。附睾上皮内的这些细胞类型具有单独的功能，同时主要细胞在相邻细胞之间形成紧密连接以产生血-附睾屏障保护免受免疫原性反应，以防止精子进入附睾上皮内，这对于附睾管腔内的稳定和特异性微环境是必要，细胞连接的调节被认为是附睾内精子成熟过程中的关键决定因素［13］。精子成熟涉及附睾上皮周围的固有层，附睾上皮，精子腔内的精子和精子本身之间的高度协调的相互作用为精子成熟提供条件。这种分段特点决定了附睾各个区段各异的生理功能，也为精子的发育成熟提供了腔内微环境。

白消安是一种烷化剂，临床上作为白血病、恶性淋巴瘤等疾病的缓解治疗常用药，同时亦是建立少精子、无精子动物模型经典用药之一［14］。白消安可破坏睾丸中分化的精原细胞使生精功能障碍，对附睾的形态结构和功能具有毒性损害作用，尤其是成熟精子前向运动和受精能力［3，15］。有研究报道，白消安可使小鼠附睾头部和尾部上皮细胞增高，减少含有的高尔基体和脂质，附睾管室内腔窄，毒性可持续存在附睾管中引起的精子损伤［16］；促进活性氧物质（ROS）的形成，ROS 升高能刺激附睾上皮脂质过氧化（LP），信号转导改变，使DNA 损伤和生精上皮细胞破坏［17，18］，LP 和氧化应激诱导，使附睾结构和内环境发生改变。附睾损伤，上皮分泌降低，细胞含有囊泡细胞质退化，其存储与精子成熟相关物质减少。致密囊泡和脂滴的增加，在某些情况下占据了整个细胞的细胞质，促进细胞肿胀，上皮细胞增加和不稳定以及囊泡积聚可能引发附睾分泌模式的改变，可能导致精子成熟不足和运动性降低。在实验观察中，模型组附睾上皮细胞分布错杂，附睾管柱状上皮细胞显现出退行性变化；管腔直径变窄，上皮高度增加，局部组织细胞水肿，空泡化的基底部胞质数目明显上涨，局部可见缺失；精子结构破坏，呈大小形状不一的线圈状。经治疗后，续断组附睾上皮主细胞中的高尔基复合体内质网、线粒体形态完整，排列整齐，上皮高度和管腔直径正常，较多数目成熟精子存在于附睾管腔内。有文献报道，上皮细胞增加和囊泡积聚可能引发附睾吸收功能的改变，阻碍精子在附睾管室内正常运转通过时间［19］，在附睾头部和尾部精子通过时间的加速度缩短。实验研究表明，少精子症模型小鼠中附睾精子的浓度、活动力、显微、超微结构、血清生化酶学的结果改变，与小鼠附睾组织内显微、超微结构和微环境变化有着密切的联系。

中医对男性不育症的论治多从肾、脾肾、肝肾等方面出发。通过相关文献探究和对实际临床经验的总结，本课题组发现“营气不从，肾精亏虚”是导致男性不育症的重要因素，其中“营气不从”为睾丸局部气血运行不畅；睾丸附睾局部气血运行受阻，营卫失和，脉管通透作用失司，经络阻隔，营养物质不能得到交换，肾失所养，发为不育。治以“补脾强肾、活络通滞”的续断种子方。该方见于《医学正印》一书，书中岳氏认为此方得种子生息之元，生精最速［20］。方中续断、骨碎补，两药合用以通为补，补肾精祛瘀滞，使新生之精可循行畅达而不淤堵。党参、山药、白术培土补益脾胃，脾胃强后天之气得养，血之化生有源，血足则肾精充养不绝；枸杞子、菟丝子、女贞子促进肾中之精的生成转化，补足肾中之精；牛膝填精善载药下行、红藤入血分行瘀滞、杜仲暖肾精通除下焦之邪气；淫羊藿强肾壮阳；诸药合用，共奏补脾强肾生精、活络祛瘀通滞功效。药理研究表明，枸杞子、菟丝子可以恢复被破坏的睾丸内细胞，降低细胞凋亡的发生，总黄酮可以抑制氧化应激相关指标的生成，提高精液质量，调节性激素分泌水平，抑制生精上皮细胞凋亡［21，22］。女贞子内含丰富的微量元素Zn，可提高氧化活性，加速生精细胞增殖，为精子发育成熟提供条件［23］。牛膝总皂苷可以抑制IL-6，Th17 的分泌，减少炎症因子的含量［24］。续断、杜仲增强睾酮的合成能力，促进性激素的分泌，减少精子氧化反应，提高精子活力［25，26］。

综上所述，本研究表明，续断种子方有效改善少精子症模型小鼠附睾结构，维护附睾上皮结构稳定性，改善附睾精子成熟微环境，为附睾培育精子成熟创造有利的条件。续断种子方对少精子症模型小鼠附睾保护精子具体作用机制还有待进一步深入研究。

作者贡献度说明：

刘金尧：动物造模，数据整理，论文写作；何明：数据分析及相关实验指标分析；唐振宇：实验指标及数据整理；杨德芬：文献查找；王权胜：论文审核。

所有作者声明不存在利益冲突关系。