红花黄色素通过TGF-β1 通路抑制百草枯诱导的肺纤维化研究

吴肇春 苏琦桐 方琳 陈坤 姜政华 廖凯君

百草枯(Paraquat, PQ)是一种高效除草剂, 在发展中国家还广泛使用。PQ 毒性极强, 据报道, 只要服用5 ml 以上的PQ 溶液就会导致严重毒性, 甚至死亡［1］。PQ 中毒后, 患者出现多器官急性衰竭, 接着是进行性肺纤维化, 最后死于呼吸衰竭。肺纤维化是PQ 中毒最典型的特征, 也是其主要的死亡原因, 发生于PQ 摄入后的几天到几周［2］。红花黄色素(Safflower yellow, SY)是从红花的花瓣中提取出的天然黄色素单体, 为查耳酮类化合物, 临床用于治疗心绞痛［3］。本课题组前期研究发现SY 具有抗PQ 诱导的大鼠肺纤维化作用［4］,SY 具有治疗PQ 中毒引起的肺纤维化的应用价值。然而, SY 抗PQ 中毒引起的肺纤维化的机制尚不明确,仍有待于探索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 注射用红花黄色素(浙江永宁药业股份有限公司, 国药准字Z20050146, 规格：50 mg, 批号：180205), 百草枯溶液(山东绿霸化工股份有限公司, 农药登记证号：PD200813, 规格：20%, 批号：171003),E-Cadherin、α-SMA、TGF-β1酶联免疫试剂盒(上海拜沃生物科技有限公司, 批号分别为20200611、20200611、20200607), E-Cadherin、α-SMA、TGF-β1抗体(武汉博士德生物工程有限公司, 批号分别为200121、200122、200121)

1.1.2 实验动物 由浙江省医学科学院提供的24 只体重约为200 g 的Sprague-Dawley 大鼠, 清洁级, 雄性,许可证号：SCXK(浙)2019-0002, 动物实验伦理编号：FJMU IACUC 2019-0117。

1.2 方法

1.2.1 分组及造模方法 将24 只大鼠随机分为NS组、PQ 组、SY 组、PQ+SY 组, 每组6 只。PQ 组和PQ+SY 组通过腹腔注射PQ 溶液(20 mg/kg)建立肺纤维化模型, NS 组和 SY 组给予等体积生理盐水。24 h 建模成功后, SY 组和PQ+SY 组灌胃25 mg/(kg·d)的SY进行干预治疗, NS 组和PQ 组每天给予等体积的生理盐水。7 d 后处死, 取出肺组织用于后续实验。

1.2.2 HE 染色和Masson 染色 取大鼠右肺, 用体积分数为 4%的多聚甲醛固定, 常规石蜡包埋, 切片, 厚度5 μm, HE、Massion 染色后, 光学显微镜下镜下观察大鼠肺组织的病理改变。

1.2.3 RT-PCR 检测基因表达水平 组织总RNA 采用Trizol 试剂盒进行提取, 反转录合成cDNA, 通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增, PCR 反应条件为：95 ℃预变性2 min, 95℃变性5 s, 60℃退火10 s, 40 个循环。根据实时荧光定量PCR 试剂盒说明书法检测靶基因mRNA 表达, 通过2-△△Ct法进行计算。

1.2.4 蛋白印迹法检测蛋白表达水平 组织总蛋白采用RIPA 试剂盒进行提取, 各组TGF-β1蛋白、E-Cadherin、α-SMA 采用BCA 试剂盒进行定量, 每组使用相等的蛋白上样量在100 g/L 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)浓缩胶上样孔中进行点样并电泳分离, 通过半干转膜法, 将分离的蛋白转移至PVDF 膜上, 5% 脱脂牛奶封闭2 h, 一抗4℃孵育过夜,通过TBST 缓冲液清洗PVDF 膜, 二抗孵育2 h, ECL 显色液显影。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 两组比较采用t 检验；多组比较采用方差分析。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SY 减轻肺组织病理变化分析 NS 组和SY 组肺泡组织结构正常；PQ 组展现了明显的肺纤维病理改变：增厚的肺泡壁, 大量炎症细胞浸润, 胶原沉积；PQ+SY组展现了SY 减轻了炎症程度。见图1。

图1 HE 染色检测肺纤维化大鼠肺组织病理变化 (×200)

2.2 SY 减轻肺组织胶原沉积分析 NS 组和SY 组中没有发现明显胶原沉积, 支气管附近发现有少量胶原存在；PQ 组中发现有大量胶原纤维形成, PQ+SY 组中也发现了胶原纤维沉积, 但相比于PQ 组明显减轻。见图2。

图2 Masson 染色检测肺纤维化大鼠肺组织纤维化改变 (×200)

2.3 SY 降低TGF -β1基因表达分析 NS 组、PQ 组、SY 组、PQ+SY 组SY 组 大 鼠 肺 组 织 中TGF -β1相对mRNA 表达水平分别为(1.00±0.20)、(2.63±0.12)、(1.28±0.26)、(1.52±0.08)。NS 组与SY 组大鼠肺组织中TGF -β1相对mRNA 表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；PQ 组大鼠肺组织中TGF -β1相对mRNA表达水平高于NS 组, 差异具有统计学意义(P<0.05)；SY+PQ 组大鼠肺组织中TGF -β1相对mRNA 表达水平低于PQ 组, 差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 RT-PCR 检测四组大鼠肺组织中TGF-β1 mRNA 的表达情况

2.4 SY 降低上皮间充质转化相关蛋白表达分析NS 组、PQ 组、SY 组、PQ+SY 组大鼠肺组织中TGF-β1蛋白表达水平分别为(0.150±0.012)、(0.340±0.013)、(0.120±0.034)、(0.290±0.020)μg/ml, E-Cadherin 表 达水平分别为(0.700±0.066)、(0.280±0.039)、(0.820±0.116)、(0.560±0.050)μg/ml, α-SMA 表达水平分别为(0.930±0.021)、(1.840±0.090)、(0.850±0.093)、(1.490±0.060)μg/ml。NS 组 与SY 组 大 鼠 肺 组 织 中TGF-β1蛋 白、E-Cadherin、α-SMA 表 达 水 平 比较差异无统计学意义(P>0.05)；PQ 组大鼠肺组织中TGF-β1蛋 白、α-SMA 表 达 水 平 高 于NS 组,E-Cadherin 表达水平低于NS 组, 差异具有统计学意义(P<0.05)；SY+PQ 组大鼠肺组织中TGF-β1蛋白、α-SMA 表达水平低于PQ 组, E-Cadherin 表达水平高于PQ 组, 差异具有统计学意义(P<0.05)。见图4, 图5,图6。

图4 蛋白印迹法检测四组大鼠肺组织TGF-β1 蛋白的表达情况

图5 蛋白印迹法检测四组大鼠肺组织E-Cadherin 的表达情况

图6 蛋白印迹法检测四组大鼠肺组织α-SMA 的表达情况

3 讨论

引起肺纤维化的原因很多, 可被药物、粉尘、病原微生物等最常见致病因素诱导［5］。PQ 是一种无选择性的除草剂, 对人和动物可致剂量依赖性肺纤维化,大鼠腹腔内注射PQ 诱导肺纤维化模型与人类的病变类似, 被广泛应用于肺纤维化的研究。本实验利用PQ建立大鼠肺纤维化模型, 观察了SY 对大鼠肺纤维化进程的影响, 发现其可以缓解肺纤维化进程, 具有较好的治疗作用。

TGF-β1是一种多功能细胞因子, 具有影响细胞增殖、分化、凋亡和细胞外基质来调节组织形态和分化的作用［6］。研究者认为TGF-β1是诱导组织纤维化包括肺纤维化的一个关键因子［7］。研究发现特发性肺纤维化患者肺中TGF-β1上调, 大鼠肺中活性的TGF-β1表达诱发显著的纤维化反应, 而没有表达TGF-β1的大鼠肺纤维化程度较轻［8］。TGF-β1最初被描述为正常乳腺上皮细胞中上皮细胞间质转型(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的诱导物［9,10］,并且之后也被证明在体外许多不同的上皮细胞包括肾近端小管、晶状体和肺泡上皮细胞中介导EMT［11］。本研究发现SY 可以同时抑制TGF-β1mRNA 和蛋白的表达, 表明SY 可通过下调TGF-β1通路, 抑制PQ诱导的肺纤维化。

PQ 对肺上皮细胞的损伤引起促炎性和促纤维化细胞因子的释放, 从而产生促纤维化环境, 其特征是(肌)成纤维细胞聚集、胶原和基质沉积以及结构重塑［12］。炎症细胞的募集和肌成纤维细胞和成纤维细胞生成的胶原能介导细胞外基质(excess accumulation of extracellular matrix, ECM)蛋白过度沉积, 继而形成肺纤维［13］。最近的研究表明, 肌成纤维细胞是肺组织纤维化的标志, 肌成纤维细胞的来源有多种, 上皮细胞的转分化是其重要来源之一［14］。上皮细胞的转分化是一种生物学现象, 极化的上皮细胞经历各种生化改变, 产生活动的间质细胞, 进一步分化为成纤维细胞和肌成纤维细胞［15］。上皮细胞和间充质细胞在形态学和功能上不同：上皮细胞为极化粘附型细胞, 细胞粘附力强, 迁移潜能有限, 其标志物为E-Cadherin。间充质细胞不极化, 呈纺锤形, 迁移能力强, 其标志物为α-SMA［16］。本研究发现SY 能够提高肺纤维化大鼠肺组织中的E-Cadherin 表达, 降低α-SMA 表达, 表明EMT 作用可被SY 抑制。

综上所述, SY 可能通过抑制TGF-β1蛋白、α-SMA 的表达来抑制PQ 诱导的肺纤维化。