褪黑素对去势小鼠椎体生物力学性能影响的研究

周永富 徐海英

骨质疏松症是一种由于骨代谢失衡, 致使以骨组织显微结构异常和骨密度降低为特征, 从而导致骨骼脆性增加, 并容易引发骨折的一种全身性骨代谢性疾病。骨质疏松症也是中老年的常见病和多发病, 根据发病性质分为原发性和继发性两大类。它的防护和治疗不仅需要巨大的人力和物力, 还会给家庭乃至整个社会带来沉重的负担［1］。据统计, 2010 年内, 美国50 岁以上的人群中>1/10 患有骨质疏松症［2］。若不采取干预措施, 未来25 年内, 全球范围内骨质疏松症患者的数量预估将增加两倍［3］。全球每年约有8900 万人确诊有骨质疏松性骨折, 这意味着每3 秒钟则有一例骨质疏松性骨折发生［4］。而现在对骨质疏松性骨折的治疗仍有诸多困难, 其总体疗效难让医生和患者满意。随着全球老龄化进程加剧, 由骨质疏松导致的骨折,不仅严重影响患者个人, 还会给医疗系统, 甚至整个社会造成沉重负担［5］。有研究已证明, 褪黑素能通过促进成骨细胞增殖分化, 抑制破骨细胞形成从而维持骨代谢的稳态并发挥防治骨质疏松症的作用［6］。本实验从生物力学的角度, 观察褪黑素干预措施对去势小鼠L3椎体生物力学性能的影响, 旨在探讨并验证褪黑素防治原发性骨质疏松症的疗效, 报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 由南方医科大学实验动物中心提供, 48 只9 周龄SPF 级雌性C57BL/6J 小鼠。饲养环境：环境温度20～25℃(恒温), 湿度40～60%(恒湿), 光照每12 小时明暗交替。小鼠分笼饲养, 4 只/笼, 自由饮食, 干燥饲料均按照国家啮齿类动物喂养标准。

1.1.2 药品与试剂 己烯雌酚(纯度99%, 上海信谊药业有限公司)；褪黑素(纯度99%, 美国Sigma 公司),乙醇(浓度2%, 上海碧云天生物技术有限公司)。

1.1.3 仪器 lnstron 万能材料试验机(美国lnstron公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组及手术造模 48 只9 周龄的雌性C57BL/6J 小鼠在SPF 动物房适应性喂养3 周至12 周龄,到达性成熟后使用随机数字表法将48 只小鼠分为假手术组(Sham 组, 12 只)和去卵巢组(36 只)。去卵巢组小鼠采取背侧切口行双侧卵巢切除术, 而Sham 组小鼠行双侧卵巢周围少量脂肪组织切除术。术后更换垫料,注意保暖, 保持笼内清洁, 观察所有小鼠至麻醉完全清醒。所有小鼠均采用颈部皮下注射0.1%氨苄西林溶液0.2 ml/d, 术后连续给药3 d, 并预防感染。饲养期间及时观察小鼠的伤口愈合、进食和活动情况。

1.2.2 分组及药物干预 术后1 周, 将去卵巢组36 只小鼠按体重随机分为模型组(Control 组)、己烯雌酚组(DES 组)和褪黑素组(Melatonin 组), 每组12 只。所有小鼠自由饮食, 饲养标准均由南方医科大学实验动物中心保证。Melatonin 组小鼠以褪黑素溶液灌胃,褪黑素使用前需要溶于2%的乙醇溶液中, 按40 mg/kg的量给药, 1 次/d；DES 组小鼠以己烯雌酚溶液灌胃,按22.5 μg/kg 的量给药, 1 次/d；Control 组小鼠以等体积的2%乙醇溶液灌胃, 1 次/d；Sham 组以等体积的蒸馏水灌胃, 1 次/d。

1.2.3 取材 所有小鼠经过不同方式干预后, 分别于第4、8、12 周末应用CO2气体窒息方法, 每组小鼠随机处死3 只, 完整取出各组小鼠的L3椎体。用剪刀剪除L3椎体棘突及附件, 并用细砂纸将其打磨成与纵轴垂直, 并上下平面平行的高度约为5 mm 三棱柱体。制取过程中, 各标本均用生理盐水纱布包裹, 处理结束的L3椎体标本均置于-20℃冰箱保存, 在生物力学测试前晚取出解冻。

1.2.4 椎体生物力学测试 利用Instron 万能材料试验机进行椎体压缩试验, 将4 组小鼠的L3椎体置于试验机上, 取加载速度1 mm/min 进行测试, 增大负载至椎体破裂, 观察受力峰值分布并记录最大压力负荷。

1.3 统计学方法 采用SPSS25.0 统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用单因素方差分析。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠L3椎体最大压力负荷的变化分析 各组小鼠L3椎体最大压力负荷随时间的变化均呈现下降的趋势, 其中Sham 组和DES 组最大压力负荷高于Control 组和Melatonin 组, 且曲线变化幅度稍小；Melatonin 组最大压力负荷高于Control 组。见图1。

图1 各组小鼠L3 椎体最大压力负荷的变化

2.2 第4 周末时各组小鼠L3椎体的最大压力负荷比较 第4 周末时, Melatonin 组平均最大压力负荷为31.67 N, 小于Sham 组的35.67 N 和DES 组的36.67 N,但显著高于Control 组的27.00 N, 差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 第4 周末各组小鼠L3 椎体的最大压力负荷比较

2.3 第8 周末时各组小鼠L3椎体的最大压力负荷比较 第8 周末时, Melatonin 组平均最大压力负荷为28.00 N, 小于Sham 组的32.67 N 和DES 组的33.33 N,但显著高于Control 组的23.33 N, 差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 第8 周末各组小鼠L3 椎体的最大压力负荷比较

2.4 第12 周末时各组小鼠L3椎体的最大压力负荷比较 第12 周末时, Melatonin 组平均最大压力负荷为23.33 N, 小于Sham 组的29.00 N 和DES 组的29.33 N,但显著高于Control 组的18.67 N, 差异具有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 第12 周末各组小鼠L3 椎体的最大压力负荷比较

3 讨论

褪黑素是一种主要由脑部松果体分泌的吲哚杂环类激素, 又称为松果体素, 在神经保护、睡眠、昼夜节律调节、学习记忆、情绪调控和多种癌症中发挥着有益的作用［7,8］。褪黑素主要储存在松果体中, 但研究发现, 如胸腺、脾脏、胃肠、睾丸、卵巢和骨髓等其他组织,也可合成并分泌褪黑素［8］。褪黑素的分泌具有昼夜节律性, 夜间高于白天, 约凌晨2:00 达到峰值；骨重建受多种激素及细胞因子调节的影响, 在骨细胞方面也表现出昼夜节律性, 夜间骨髓的褪黑素分泌水平是血浆2 倍, 骨组织在夜间生长速度最快, 进一步提示褪黑素的分泌可能与骨代谢有关联［9］。随着年龄增长, 褪黑素夜间分泌浓度下降, 昼夜节律变缓, 女性绝经后夜间血浆褪黑素分泌浓度及时长均低于绝经前［6］。

有研究报道, 骨折发生的风险程度与夜晚工作存在相关性, Feskanich 等［10］发现夜晚工作经历超过20 年的人群, 其手腕和髋部骨折风险程度在未来8 年中显著升高, 推测其可能的机制是由于夜晚工作影响褪黑素分泌水平, 进而影响骨生长, 增加骨折风险。Amstrup 等［11］通过对81 例绝经后女性进行为期一年的高低剂量褪黑素或安慰剂治疗后, 发现褪黑素有助于提升患者睡眠质量, 且未影响肌肉功能, 且低剂量褪黑素治疗组女性的股骨颈的骨密度增加, 高剂量治疗组女性的股骨颈和脊柱骨密度增加, 提示保证良好的睡眠及褪黑素的夜间分泌水平, 有减缓骨丢失和骨质疏松的可能。Kotlarczyk 等［12］通过对18 名围绝经期女性进行褪黑素和安慰剂治疗半年后, 用超声评估发现两组跟骨骨密度无显著变化和差异, 但测定骨形成标志物血清骨钙素(OC)和骨吸收标志物尿Ⅰ型胶原交联氨基末端肽(NTX)后发现, 褪黑素组OC/NTX 比值显著升高, 而安慰剂组OC/NTX 比值则无显著变化, 提示褪黑素有维持成骨细胞和破骨细胞之间的平衡的作用。

骨重建的持续及其矿化平衡的维持是维持骨骼自身结构完整的前提, 而成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡和调节, 是实现骨形成和骨吸收平衡的基础。褪黑素不仅能通过诱导成骨细胞的增殖与分化, 从而促进骨形成, 而且能通过多种途径直接或间接抑制破骨细胞的生成与活化, 减少骨质的溶解［6］。研究发现褪黑素能够通过增加骨钙素的表达, 促进骨生成, 抑制骨质流失, 而且能通过上调神经肽Y 和神经肽Y 受体Y1的表达, 促进间充质干细胞的增殖和迁移, 从而促进骨折愈合［13］。Maria 等［14］研究发现褪黑素对成骨细胞的诱导作用、骨增强作用和生活质量的改善表明,褪黑素是一种安全有效的骨丢失治疗方法。Koyama等［15］研究发现, 药用剂量的褪黑素能够通过抑制破骨细胞的生成和活化, 抑制骨吸收水平, 从而提高骨量。此外, 刘俊华等［16］研究发现, 褪黑素能够通过Nrf-2途径, 降低成骨细胞的氧化应激反应水平, 进而降低高铁引起的成骨细胞凋亡。

本实验中, 各组小鼠L3椎体最大压力负荷随时间的变化均呈现下降的趋势, 其中Sham 组和DES 组最大压力负荷高于Control 组和Melatonin 组, 且曲线变化幅度稍小；Melatonin 组最大压力负荷高于Control 组。第4 周末时, Melatonin 组平均最大压力负荷为31.67 N,小于Sham 组的35.67 N 和DES 组的36.67 N, 但显著高于Control 组的27.00 N, 差异具有统计学意义(P<0.05)。第8 周末时, Melatonin 组平均最大压力负荷为28.00 N,小于Sham 组的32.67 N 和DES 组的33.33 N, 但显著高于Control 组的23.33 N, 差异具有统计学意义(P<0.05)。第12周末时, Melatonin 组平均最大压力负荷为23.33 N,小于Sham 组的29.00 N 和DES 组的29.33 N, 但显著高于Control 组的18.67 N, 差异具有统计学意义(P<0.05)。从生物力学的角度验证了褪黑素对去势小鼠骨质疏松症椎体能生物力学性能的影响。

综上所述, 褪黑素能通过多种不同途径促进成骨细胞增殖分化, 抑制破骨细胞生成活化, 从而维持骨代谢的稳态, 并发挥防治骨质疏松症的作用。但目前可能需要更多的转化研究以及实验研究提供更多的证据支持, 以推进褪黑素在骨质疏松症领域的临床应用, 为临床上防治原发性骨质疏松症探索更优的新方法。