褪黑素防治骨质疏松症的作用机制与应用研究

徐杰 周永富 邓小敏 黄小雁 刘红梅

骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种由于骨代谢动态失衡导致的全身性骼疾病, 在如年龄、性别、疾病等多种因素作用下使骨量减少, 导致骨微观结构失稳,使骨骼脆性增大, 导致骨折分险大大增高［1］。作为一种中老年多性疾病, OP 主要分为两大类:包括绝经后和老年性的原发性OP；包括内分泌、代谢性和药物性的继发性OP［2］。伴随着我国正式步入深度老龄化社会, 其老年人口的不断增大导致各种类型的OP 患者数目逐年暴增, 预计到2050 年, 我国老龄妇女骨质疏松发病率高达50%～70%［3］, 患病人数每年新增达599 万,其治疗、护理及康复等需求将给个人和社会带来沉重的经济负担［4］。故对于防治OP 需求迫切, 亟待解决。

褪黑素, 即N-乙酰基-5-甲氧基色胺, 是色氨酸经过羟化和脱羧反应转化为血清素, 血清素在芳烷基胺-N-乙酰基转移酶(AANAT)和羟吲哚-O-甲基转移酶(HIOMT)共同催化下, 以N-乙酰基-5-羟色胺为中间产物, 最终转化产生的一类吲哚类激素［5］。其具有亲水及亲脂性, 可越过血脑屏障, 广泛存在于各类生物体中。人类褪黑素主要由松果体产生, 也可在胃肠道、骨髓、卵巢、视网膜、皮肤、淋巴细胞、巨噬细胞等其他组织中代谢合成［6］。褪黑素的合成和分泌由于受到下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)对光线的反应影响具有昼夜节律性, 黑暗可促进褪黑素的合成与分泌, 而光照对其具有抑制作用［7］。但其既往研究发现褪黑素除具有调节睡眠外, 还具有抗炎、抗氧化、抗骨质疏松、抑制肿瘤等作用［8］。尤其是通过调节骨代谢平衡来防治OP 方面, 相比于降钙素、维生素、钙剂、磷酸盐抑制骨流失等传统治疗OP 药物［9］, 褪黑素具有生成迅速、促进成骨快、安全性高、副作用少等特点, 作为一种潜在治疗OP 的药物［10］, 成为研究热点。鉴于此, 本文就近年来褪黑素在防治OP 的机制与应用研究方面进行综述, 以期对褪黑素防治OP 的基础与临床应用研究上予以借鉴与提供理论支持。

1 褪黑素对于骨代谢平衡的影响

OP 的发病机制目前争论较大, 但目前主流研究认为其发病机制为骨代谢失衡。人的骨骼代谢是一个动态变化的过程, 即成骨细胞形成新骨, 经代谢老化后的变性骨细胞又被破骨细胞吞噬, 而后成骨细胞补充新骨。生理状态下, 成骨能力与破骨能力均衡, 维持着正常骨代谢与更新, 但病理状态下, 破骨能力增强, 成骨能力下降, 骨代谢失衡, 导致了OP 发生［11］。研究表明褪黑素可通过褪黑素受体依赖和受体非依赖性的途径来影响骨代谢［12］。其对骨代谢影响的主要机制有两个：①抑制破骨细胞活化生成减少骨流失；②促进成骨细胞的增殖分化增加骨生成量。

1.1 褪黑素抑制破骨细胞活化生成 OP 的发生与破骨细胞过度骨吸收导致骨代谢失衡关系密切, 如褪黑素能通过抑制破骨细胞过度活化从而降低吞噬骨细胞数量, 减少骨溶解量则能达到防治OP 的目的。根据现有相关研究, 部分学者认为褪黑素能通过相关通路直接干预调控破骨细胞的活化生成, Zhou 等［13］研究发现给予不同梯度药物浓度的褪黑激素能抑制破骨细胞的生成, 且给药浓度与抑制效果成正比, 表明褪黑激素介导的抗破骨细胞生成是由活性氧(ROS)介导的, 而非通过沉默信息调节因子1(silent information regulator type 1, SIRT1)独立依耐性的途径, 可直接作用于破骨细胞。此外, 在褪黑激素处理的目标培养细胞中, 他们发现抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性细胞的数量和破骨细胞特异性标志物的基因表达均下调明显, 以此推测褪黑激素可通过调控核因子κ-光链-活化B 细胞增强剂(NF-κB)信号通路来抑制破骨细胞分化生成。Koyama 等［14］研究发现, 给予不同浓度剂量的褪黑素后, 发现破骨细胞的活性及数量与褪黑素浓度呈反比,证明了褪黑素可直接抑制破骨细胞的吞噬活性, 进而抑制骨吸收, 减少骨溶量。此外, 另一部分学者则认为褪黑素对于破骨细胞的抑制作用主要是通过褪黑素干预破骨细胞生成的相关通路或上游路径来间接实现。如针对破骨细胞抑制激素-降钙素(Calcitonin), Nakano等［15］创造性提出了褪黑素通过促进降钙素分泌来抑制破骨细胞活性来用以治疗OP 的新机制, 并在后续的试验中证明了他的猜想。Maria 等［16］使用人类间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)和人类外周血单核细胞(PBMCs)的共培养模型发现褪黑素能抑制成骨细胞NF-κB 受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)的分泌, 通过增大RANKL/骨保护素(OPG)比值诱导成骨细胞分化, 从而间接抑制破骨细胞的活化生成, 进而促进骨量沉积。

1.2 促进成骨细胞的增殖分化 成骨细胞作为一种来源于BMMSC 分化而成的促骨细胞, 现有研究表明褪黑素可通过直接或间接途径作用于成骨细胞的增殖分化, 进而延缓OP 的病理进程。刘合栋［17］通过使用过氧化氢(H2O2)构建的MC3T3-E1 细胞氧化应激损伤模型, 予以褪黑素及EX527(SIRT1 抑制剂)干预后证明褪黑素通过激活SIRT1 调节P66Shc 和SIRT3 的表达, 降低MC3T3-E1 细胞的氧化应激反应间接促进成骨进程。而Xu 等［18］的最新研究表明褪黑素抑制NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性体的活性, 进而调控雌激素含量来加速成骨细胞的增殖。而针对于抑制骨损伤的促骨钙素(osteocalcin, OCN), 相关研究［19］证实了褪黑素可通过促OCN 的表达量来抑制骨损伤, 进而促进骨生成。作为成骨细胞分化源头的骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种多能干细胞, 其可以向成骨细胞、软骨细胞、造血细胞等多种细胞分化, 可通过多种通路及信号调节促进成骨增殖进程,在防治OP 上具有巨大的应用潜力。王旭东等［2］研究发现通过增强Runx2 表达与抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)从而抑制MSCs 的成脂分化, 间接增强MSCs 成骨化进程, 加速成骨细胞生成。Dong 等［20］通过大鼠模型发现经褪黑素处理后的股骨骨折的骨折愈合程度与神经肽Y (neuropeptide Y, NPY)和NPY 受体Y1(neuropeptide Y receptor Y1, NPY1R)的表达量成正比, 与BMSCs 的增殖表达呈正比, 证明褪黑素通过增强NPY/NPY1R 信号传导促进BMMSC 的成骨分化能力, 促进成骨细胞的增殖。Chen 等［21］发现褪黑素可以通过SIRT1 介导抑制氧化来修复骨质疏松大鼠的BMMSC, 间接促进成骨细胞分化, 从而增加骨量。Jiang等［22］通过小鼠成纤维细胞发现褪黑素能显著促进骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)尤其是BMP9 表达, 加速β-连环蛋白磷酸化进程, 进而促进MSCs 的增殖和迁移, 提升成骨细胞的增殖分化能力,促进骨量提升。

2 褪黑素在防治OP 的相关应用研究

OP 的主要发病机制为骨代谢失衡导致的骨量丢失。而上述研究表明褪黑素能通过多种途径抑制破骨细胞吞噬活性来减少骨流失量, 促进成骨细胞增殖分化增加骨含量从根本上缓解骨质疏松症状。以往大量研究表明, 褪黑素在细胞试验、动物试验以及临床运用中均表现出具备抑制骨质疏松的巨大潜力, 值得挖掘研究。

2.1 细胞试验 大量细胞试验研究表明褪黑素可通过途径、多通路调控骨代谢在多种细胞模型中发挥作用来防治OP。刘合栋等［23］通过运用H2O2诱导的成骨细胞建立氧化应激损伤模型, 并用褪黑素及对照试剂予以干预后检测成骨相关蛋白SIRT1 和p66SHC 的表达量, 结果表明褪黑素降低H2O2所导致氧化应激损伤对于成骨细胞的影响, SIRT1 和p66SHC 的表达量显著增高。证实了褪黑素通过调节SIRT1/p66SHC 通路来缓解H2O2诱导的成骨细胞的氧化应激损伤, 促进成骨增殖［24］。此外, 相关研究研究表明铁过载会抑制成骨化进程导致OP 发生, 故刘俊华等［25］研究用高铁干预成骨细胞后发现细胞内氧化应激水平显著增高, 成骨细胞凋亡显著, 抗氧化应激, 核因子NF-E2 相关因子(Nrf-2)途径相关蛋白Nrf-2 及血红素氧合酶1(HO-1)表达增加, 而褪黑素组成骨细胞凋亡结果与之相反, 证实褪黑素可通过Nrf-2 途径减缓成骨细胞的氧化应激水平, 抑制高铁过载引起的成骨细胞凋亡, 间接提高成骨细胞骨化水平。此外, 褪黑素还能通过下调肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)诱导的SMAD 泛素化调节因子1(SMAD ubiquitination regulatory factor 1, SMURF1)的表达量, 进而抑制了TNF-α 表达水平, 间接促进BMSCs 成骨分化［26］。而在通过调节肠道菌群分泌及代谢产物影响成骨化进程上, 温凯程［27］发现褪黑素具有通过恢复肠道菌群平衡, 促进胆汁酸表达, 抑制骨生物节律基因 Bmal-1 转录异常, 从而促进成骨细胞的增殖分化的作用。

2.2 动物试验 基于上述细胞研究基础, 目前关于褪黑素对于防治OP 的动物试验研究除直接予以褪黑素干预的骨疏松动物模型外, 还包括研究褪黑素治疗绝经后OP 的去卵巢动物模型, 直接研究褪黑素防治骨量丢失的去松果体动物模型［28-33］。现列举如下：①直接予以褪黑素干预骨质疏松动物模型研究。Chu 等［28］服通过直接予以褪黑素对构建的老年性骨质疏松大鼠进行了干预后发现其试验组大鼠血清中的OCN 和碱性磷酸酶(bone alkaline phosphate, BAP)表达量得到显著提升, 证明了褪黑素能显著提升模型大鼠的骨小梁的数量及质量, 增加骨密度, 提升骨矿盐沉积。针对糖尿病所致的骨质疏松大鼠模型, Chu 等［28］采用不同浓度的褪黑素对大鼠模型进行直接干预后用显微CT 检查, 发现褪黑素能降低破骨细胞的自噬率, 抑制成骨细胞脂化, 改善模型大鼠的骨纤维结构, 维持骨力学形态稳定。而Maria 等［16］在小鼠模型饮用水中添加褪黑素(15 mg/L)喂养, 经过1 年干预后发现实验组小鼠血清中OPG 以及RANKL 表达量水平及RANKL/OPG比值均有显著提升, 证实了褪黑素的抗骨质疏松能力。②构建褪黑素干预绝经后OP 的去卵巢动物模型。Xu等［18］通过建立去卵巢小鼠模型, 并以不同剂量的褪黑素予以干预, 结果显示褪黑素以剂量与BAP 和OCN 表达量呈正比, 证明了褪黑素能增强成骨细胞分化, 调剂骨代谢平衡。Xiao 等［30］在研究OP 时通过构建去卵巢动物模型发现褪黑素能通过复合水凝胶体系 GelMADOPA-MT 抑制氧化应激所诱导的成骨细胞凋亡, 间接性的保护成骨细胞的增殖分化, 从而促进骨形成, 加速骨量沉积。在Choi 等［31］的研究中发现褪黑素有效阻断去卵巢小鼠体内 RANKL 诱导的破骨细胞活化进程,其主要机制为抑制不对称二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine, ADMA) 以及RANKL 下游的肿瘤坏死因子受体6(TNF receptor associated factor 6, TRAF6)的表达, 进而抑制其诱导产物破骨细胞的产生。③研究褪黑素防治骨量丢失的去松果体动物模型。褪黑素主要是由松果体产生。Aota 等［32］的通过建立去松果体鸡模型后发现被切除松果体切后的肉鸡模型其褪黑素含量极具下降, 而后大量的破骨细胞活化生成, 使松质骨结构遭到严重破坏, 尤其在软骨-骨交界处骨化严重受损, 证明了褪黑素是防治骨质疏松的一个重要途径。在另一项松果体的研究中, Egermann 等［33］分别采用卵巢切除、松果体切除、卵巢与松果体联合切除建立雌性绵羊模型后, 经一段时间后测量模型骨量发现3 组均出现骨微结构受损, 松质骨体积下降, 且以联合组的骨量丢失最为明显；经过各组对比后发现, 相比与单纯卵巢切除后模型羊骨量会急剧丢失, 但最后骨密度会保持在一个最低水平上, 去松果体组与联合组的褪黑素及其骨量则呈现出持续性的丢失状态, 表明松果体在无法产生褪黑素后会持续性诱导骨丢失,证明了褪黑素对骨形成具有重要的调控作用, 值得继续深挖其抗骨质疏松的潜力。

2.3 临床试验 褪黑素除具有调节睡眠外, 还具有抗炎、抑制氧化、抗骨质疏松、抑制肿瘤等作用, 特别是抗骨质疏松, 是近年来的一个临床研究热点。

首先在褪黑素的安全性研究上, 动物试验上,Yousaf 等［34］通过建立大鼠模型并予以大剂量外源性的褪黑激素进行干预后, 并未出现任何毒副作用反应,证明了其安全性。Jahnke 等［35］给予妊娠期大鼠予以大剂量褪黑素直接干预后, 结果表明褪黑素没有对母代及其子代胎儿产生任何毒副作用, 证明了褪黑素的安全性。在临床人体安全性试验上, Hansen 等［36］采用随机双盲试验对19 例受试者给予低剂量口服褪黑素或安慰剂一段时间后, 对两组受试者分别进行注意力、反应力、感觉能力、运动协调性等综合评估后, 发现褪黑素除会增加嗜睡外, 并无其他明显的神经副作用。党卫民等［37］对7 名健康志愿者进行光照治疗用以探究褪黑素的分泌节律及其安全性, 结果发现试验前后的生理、生化、心电图、脑电图、心理测评等均无明显异常, 且睡眠程度均有明显改善, 证明了褪黑素的临床安全性。

基于上述相关动物及临床安全性研究的基础上,为探究褪黑素对于绝经后骨质疏松女性的治疗效果,Amstrup 等［38］采取双盲随机对照试验, 对81 例绝经后骨质疏松女性予以不同剂量的褪黑素或安慰剂治疗1 年后, 结果显示不同剂量的褪黑素组均能提升患者的成骨进度, 提升骨密度水平, 且不同剂量组间呈现出剂量越高, 成骨效果越好的趋势。证实了褪黑素对于绝经后骨质疏松女性患者有明确的治疗效果。Maria等［39］对绝经后骨质疏松女性患者进行为期1 年的随机双盲试验, 各组分别予以褪黑素+锶(柠檬酸)+维生素D3+维生素K2干预治疗和安慰剂治疗后, 评估两组的骨密度变化和生活质量的改变。结果表明联合治疗组相比安慰剂组在减轻围绝经期各种症状、提高睡眠质量、改善情绪、缓解骨质疏松症状等具有明显优势,说明了褪黑素联合疗法对于防治老年性骨质疏松上具有明确的积极意义, 值得继续深入研究与探索。

3 展望

随着我国逐渐步入深度老龄化国家, 作为中老年常发疾病的OP 正逐渐成为一个现实问题摆在眼前。尽管目前已有多种治疗方法与药物来防治OP, 但其或多或少都存在各种如副作用大、安全性低、治疗时间长等问题, 因此, 探究新的治疗途径就十分有必要。

如上所言, 本综述说明了褪黑素在防治OP 的详细作用机制, 明确了褪黑素在防治OP 的具有十分积极意义。多项证据表明褪黑素可通过多途径、多通路来抑制骨质疏松的病理进程, 但其治疗作用机制存在争论,未深入探究其具体作用机制。同时, 虽然目前相关细胞、动物试验研究众多, 但相关研究临床转化与运用较少, 目前尚未开发出褪黑素在防治OP 的具体特效药物。在人体试验方面, 多以联合治疗为主, 缺乏大样本量的单独对褪黑素治疗OP 的临床研究。这些都是以后的研究重点, 值得继续深入研究探讨。