白及锈病的病原鉴定及其田间防治药剂筛选

徐明癑　江健伟　刘艮森等

关键词 白及；锈病；Coleosporium bletiae；病原鉴定；药剂防治

中图分类号：S 435.672 文献标识码：A DOI： 10.16688/j.zwbh.2022211

白及Bletilla striata是多年生兰科白及属植物，广泛分布于中国、日本、韩国和缅甸。在我国，现多分布于湖北、贵州、广西、四川、云南等地[1]。白及是我国传统兰科药材之-[2]，其药用部分主要是富含白及多糖胶的地下假鳞茎。白及多糖胶具有收敛止血、清热解毒、消肿生肌之功效，常用于治疗消化道黏膜损伤、溃疡、出血、擦伤和烧伤、皮肤皲裂等[3-5]。由于白及具有较高的药用、观赏和经济价值，对其需求量不断增大，愈来愈多的野生资源被广泛掠夺。因其繁殖能力较低，生长速度缓慢，导致我国野生白及急剧减少，濒临灭绝，现已被《中国植物红皮书——稀有濒危植物》收录，同时也被写入了《濒危野生动植物国际贸易公约》保护种类[6-7]。

近年来，随着白及需求量增加，价格迅速上涨，大规模人工种植的白及越来越多[8]。而由于栽培管理措施、田间小气候等因素的影响，白及病害种类、分布、发生面积增加，危害逐年加重。已报道的病害有：由Fusarium commune、F.asiaticum、F.ipomoe-ae、F.solani和Epicoccum sorghinum侵染引起的白及叶斑病[9-13]；Colletotrichum orchidophilum和C.fruc-ticola引起的炭疽病[14-15]3；Sclerotium rol fsii引起的白绢病[16]；Phytophthora nicotianae引起的疫病[17]；由Dactylonectria torresensis引起的根腐病和F.fujikuroi引起的茎腐病[18-19]；Coleosporiumbletiae引起的白及锈病[20]等。

白及锈病具有传播性强、不易防治的特点，其在湖北地区于每年4月中旬开始发生，一直可以持续至11月上旬，特别是5月-8月是锈病的大暴发时期。然而，自发现白及锈病以来，其病原体特征尚未被清楚地描述，其有效防治药剂鲜见报道，这可能也是导致该病未能很好防治的主要原因。

2018年6月，白及锈病在华中地区，特别是湖北省的多个白及种植区大面积发生，发病率超过50%，有的种植区甚至达到90%。本研究从2018年6月起在湖北省恩施州来凤县白及种植区进行白及锈病调查，利用形态学和分子生物学相结合的方法对其病原进行研究，同时选择5种药剂对该病进行田间防治试验。

1材料与方法

1.1样品采集

2018年—2019年，在湖北省恩施州来凤县白及种植区（29°58′N，109°40′E，海拔558m）调查白及锈病发生情况，发现锈病发病率普遍高于80%。分别于2018年6月和2019年10月采集带有明显病征的白及锈病病株和病叶样品，放人无菌的牛皮纸袋中保存并编号，带回实验室后立即进行显微观察。并分别收集其夏孢子和冬孢子堆，放置于干燥的无菌离心管中，4℃保存备用。为方便描述，将本研究白及锈病病原编号为BSC1。

1.2致病性测定

选取长势一致的健康2年生白及植株移栽于塑料育苗盆中，每盆4株，使用PE手套摩擦白及叶片上下表面，擦掉蜡质层。随后将收集的夏孢子配制成孢子悬浮液（105个/mL），每株喷洒10 mL孢子悬浮液，对照喷洒等量无菌水，每个处理2盆。所有接种后的植株放置于自然环境（白天约30℃，夜晚约15℃，相对湿度80%～100%）中。每天观察，45 d后拍照记录发病情况。根据病菌的显微形态对发病叶片上的病原再鉴定，进行柯赫氏法则验证。

1.3形态学观察

取具有典型病征的样本，在连续变倍体视显微镜（南京永新光学有限公司，NS2-608T，中国）下对其冬孢子堆进行徒手切片，并用无菌针挑取病原菌的夏孢子和冬孢子，以无菌水作为浮载剂在显微镜（Nikon，DS-Ri2，日本）下观察并测量其大小。

1.4分子系统学鉴定

取锈病病原（ BSCl）的夏孢子约200 mg，置于1.5mL无菌离心管中，采用改良CTAB法提取其基因组总DNA[21]。利用核糖体内转录间隔区（in-ternal transcribed spacer，ITS）和核糖体大亚基（large subunit，LSU）基因序列引物进行PCR扩增，引物委托武汉华大基因科技有限公司合成，序列见表1。

PCR反应体系（50μL）：DNA模板3μL，2×SuperStar Omni PCR Master Mix（Genestar，中国）25μL，正、反向引物（10μmol／L）各2μL，ddHO补足至50μL。ITS和LSU基因的PCR扩增程序：95℃预变性5 min; 95℃变性45 s，55℃退火45s，72℃延伸30s，共34个循环；72℃再延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送武汉华大基因科技有限公司进行测序。所获得的序列经DNAstar峰图校正后，利用GenBank数据库的BLASTn工具进行同源性比对，并选择下载相应参考序列。使用在线多序列比对工具MAFFT[24]（http：∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/）分别对ITS和LSU序列进行多序列比对，随后经修剪和拼接ITS和LSU序列，并在MEGA7.0中构建系统发育树，进行建树模型评估选择，进化树采用自展法（ bootstrap）進行检测评估，1000次循环。

1.5田间防治药剂筛选

供试药剂：10%苯醚甲环唑水分散粒剂（WG），先正达南通作物保护有限公司；15%三唑酮可湿性粉剂（WP），江苏七洲绿色化工股份有限公司；250 g/L吡唑醚菌酯乳油（EC），巴斯夫植物保护（江苏）有限公司；12%萎锈灵可湿性粉剂（WP），陕西恒田生物农业有限公司；80%代森锰锌可湿性粉剂（WP），美国陶氏益农公司。

试验地点为湖北省来凤县白及人工种植基地。试验共设置6个处理：1）10%苯醚甲环唑WG60g／hm（有效成分用量，下同）；2）15%三唑酮WP180 g／hm；3） 250g/L吡唑醚菌酯EC 180g／hm；4） 12%萎锈灵WP 108 g／hm；5）80%代森锰锌WP 1200 g／hm；6）清水对照。每处理重复3次，共18个小区，每个小区面积30 m，随机区组排列。试验于2020年4月25日至5月16日进行，共施药3次，每次间隔7d。施药时，按照常规施药方式，使用背负式电动喷雾器（3WDB-20L）对白及叶片正反面和茎部均匀喷雾，空白对照处理喷施等量清水。试验过程中，共调查4次，分别为施药前病情指数调查（4月25日）、第1次施药后7 d（5月2日）、第2次施药后7 d（5月9日）和第2次施药后14 d（5月16日）。每小区采用对角线五点取样法，每点10株，每株调查最上方的3个叶片，记录病叶发病面积，以每张叶片上病斑面积占整个叶面积的百分率进行分级[25]。分级标准：0级，无病斑；1级，病斑面积占整片叶面积的5. 1%以下；3级：病斑面积占整片叶面积的5.1%～25%；5级：病斑面积占整片叶面积的25.1%～50%;7级：病斑面积占整片叶面积的50.1%～75%;9级：病斑面积占整片叶面积的75%以上。

根据调查数据按下式计算各处理小区的防治效果，并使用SPSS软件处理调查数据，采用Duncan氏新复极差法对数据进行方差分析。

病情指数=∑（各级病叶数×相应级值）／（调查总叶数×最高级值）×100；

防治效果=[1－（药剂处理区施药后病情指数－药剂处理区施药前病情指数）／（空白对照区施药后病情指数一空白对照区施药前病情指数）]×100%。

2结果与分析

2.1田间发病症状

白及锈病的病原属于专性寄生菌，具有较强的传播能力。在田间，从4月至11月，其夏孢子可以反复侵染白及植株，发病率可达100%。该病发生初期，叶片正面呈现褪绿小黄斑（1～3mm），随后叶背面出现散生、圆形、粉状凸起的橘黄色夏孢子堆，直径约1～5 mm，周围有黄色晕圈。夏孢子是田间再侵染的主要来源。当病害发生严重时，整个叶片上密布几十至上百个形状大小不等的夏孢子孢子堆，导致叶片光合作用受阻，叶片扭曲、枯萎，最后脱落（图1）。10月中旬以后，气温逐渐降低，在夏孢子堆周围会出现红褐色的冬孢子堆，呈圆环状（图2c）。

2.2病原夏孢子的致病性

接种夏孢子20 d后，白及叶片表面出现典型的淡黄色褪绿病斑，背面出现少量黄色夏孢子堆。45 d后，叶片下部（靠近叶鞘部）出现黄化、坏死和大量的孢子堆，症状与田间发病症状相似（图1b～c）。

2.3病原夏孢子和冬孢子的形态

白及锈病病原的夏孢子呈卵圆形或长椭圆形，单细胞，表面有疣状突起，（32.1±4.72）μm×（20.6±2.5）μm（n=30）（图2a～b）。冬孢子堆生于叶背表皮，呈垫状，橘黄色（图2c）。冬孢子棍棒状，由2～4个细胞组成（1～3横隔膜），大小为（108. 48±10.84）μm×（17. 97±2.56）μm（n=30）（图2d～e）。

2.4分子生物学鉴定

将获得的白及锈病病原的ITS（636 bp）和LSU（650 bp）基因序列提交至GenBank数据库，登录号分别为MN108161和MN10 8162。利用ITS和LSU联合基因序列，以K2模型构建neighbor-join-ing（NJ）系统发育树，进化树结果表明，白及锈病病原与4个鞘锈属真菌Coleosporium euodiae HMBF-11、C.campanulae HMBF-41501、C.pedic-ularidis HMBF-74454、C.bletiae N87聚为一簇，其bootstrap支持率为99%。其中该锈病病原（BSCl）与C.bletiae N87聚为一个亚支，其bootstrap支持率为91%，表明白及锈病的病原为鞘锈菌属真菌Coleosporium bletiae（图3）。

2.5田间防治药剂的筛选结果

5种药剂对白及锈病的防治效果有较大的差异（表2）。250g/L吡唑醚菌酯EC与12%萎锈灵WP对白及锈病的防控效果最好，第1次施药后7d防效均在78%以上，其中250g/L吡唑醚菌酯EC在第2次施药后的第14天防效可达90%。80%代森锰锌WP和15%三唑酮WP在本试验中防效中等，二者无显著差异，在第2次施药后的第14天防效均可达到71%以上。10%苯醚甲环唑WG的防治效果最差，在整个施药调查周期中，其防效仅在44%～57%之间。

3结论与讨论

Coleosporium bletiae引起白及叶部锈病最早于1898年由日本学者Dietel报道[26]。根据其描述，C.bletiae夏孢子为椭球形，带疣，冬孢子棒状，由4个细胞构成，本研究结果与其描述相符，不同的是冬孢子大小为（108.48±10.84）μm×（17.97±2.56）μm，小于Dietel报道的150μm×25μm。据报道，我国台湾、西藏和贵州等地的一些野生白及分布地有白及锈病发生[20，27-28]，但是僅对病害发生区域进行了记录，没有病原的具体信息。本研究首次报道了湖北省恩施地区白及锈病的发生特点，并对病原形态及分子特征进行了描述。

锈菌的生活史可以分为3种类型，包括长循环型（macrocyclic）、缺夏孢子型（demicyclic）和短循环型（microcyclic） [29]。全世界已经发现的鞘锈菌属Coleosporium真菌约有100种[30]，大多数种的生活史是具有转主寄主的长循环型，可以产生5种不同类型的孢子，包括性孢子（pycniospores）、锈孢子（aeciospores）、夏孢子（urediospores）、冬孢子（telio-spores）和担孢子（basidiospores）[31-32]。本研究发现Coleosporium bletiae的夏孢子和冬孢子都是在其寄主（白及）上产生，而其转主寄主尚不清楚，有待进一步深入研究。

白及锈病病原的传染性极强，容易导致该病害严重发生，造成较大的经济损失，高效防治药剂的筛选是防治关键。关于白及锈病的田间防治，仅见杨帆等[33]报道了25%吡唑醚菌酯SC的防效最好，达到了91.23%，15%三唑酮WP次之，其防效为84.12%。本研究也获得了类似的结果，250g/L吡唑醚菌酯EC对白及锈病的防治效果最好，在第2次施药后14 d的防效为90.01%，另外，12%萎锈灵WP对白及锈病也具有较好的防治效果，其防效与250g/L吡唑醚菌酯EC相当。本研究中15%三唑酮WP第2次施药后14d的防效仅为71.89%，这可能是由于三唑酮长期作为湖北地区白及锈病的主要防治药剂导致病原出现了一定的抗药性。因此生产上推荐12%萎锈灵WP和250g/L吡唑醚菌酯EC作为白及锈病的防治药剂。