基于网络药理学和分子对接探讨三七总皂苷干预异位骨化的作用机制

胡珉华，冯元蓝，周若愚，孙伟鹏，汤胜尧，任悦怡，严泓松，曾文星，马路遥，姜自伟，黄枫（. 广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 50405；. 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 50405）

异位骨化（Heterotopic ossification，HO），又称骨化性肌炎，是一种在软组织中产生异常骨组织和软骨组织的疾病，可分为先天性异位骨化和获得性异位骨化。在临床上，获得性异位骨化较为常见，通常由肢体损伤、关节置换术后、神经系统损伤等创伤引起，好发于肘关节、髋关节等活动度较大的关节[1]。在病变的早期，异位骨化多表现为局部软组织的疼痛、肿胀和肤温升高，晚期由于关节附近异常骨组织的形成可造成关节功能活动受限，发生关节僵硬[2]，给患者带来了生活上的不便和心理上的痛苦，严重影响了患者的生活质量。目前，口服非甾体抗炎药、外照射治疗和手术切除异常骨组织是治疗异位骨化的常规治疗方法。然而，这些常规治疗方法具有局限性。在临床上，口服非甾体抗炎药往往容易导致一些并发症，如骨折不愈合的发生，对术后康复具有一定的影响；外照射治疗由于其价钱昂贵的因素使一些患者难以负担治疗费用；而手术治疗在短期内可以实现异位骨的清除，但是术后存在复发的风险[3-4]。因此，目前迫切需要一种安全有效的治疗方法弥补这些常规治疗的缺陷。

中药由于价钱低、疗效好、副作用少，安全系数高等优点在治疗某些难治疾病方面具有优势。三七属于五加科、人参属植物的根茎，具有散瘀止血、消肿定痛的功效，常用于治疗跌打损伤类伤科疾病[5]。三七总皂苷是从中药三七提取出的主要活性成分，具有抗炎、降脂、抗肿瘤等现代药理作用[6]。近年来，有研究[7-8]采用三七总皂苷的中成药制剂（血栓通注射液、血栓通胶囊），联合非甾体抗炎药及二磷酸盐以预防术后发生异位骨化，取得了较好的疗效。但是对于三七总皂苷干预异位骨化的物质基础、作用机制尚未有研究系统阐明。

网络药理学是一个新颖的研究领域，它将药理学和药效学相结合，通过分析各种复杂和多级相互作用的网络，阐明了许多化合物的协同效应和潜在机制。本研究旨在通过网络药理学方法和分子对接技术挖掘三七总皂苷的作用靶点，揭示其治疗异位骨化的分子机制，为未来预防和治疗异位骨化提供一定的研究思路。

1 资料与方法

1.1 三七总皂苷主要活性成分及靶点预测在临床上，常常静脉滴注含三七总皂苷成分的中成药制剂血栓通注射液来预防异位骨化的发生，因此三七总皂苷的单体成分不经过胃肠道消化而直接入血发生作用，故本研究暂不考虑三七总皂苷各单体成分的口服利用度属性，而考虑药物含量对药效的影响。查阅《中华人民共和国药典》[9]发现，在三七总皂苷各成分中，三七皂苷R1 含量不低于5%、人参皂苷Rg1 含量不低25%、人参皂苷Re 含量不低于2.5%、人参皂苷Rb1 含量不低于30%、人参皂苷Rd 含量不低于5%；并且这5 种皂苷类单体成分总量占血栓通注射液（三七总皂苷）的85%以上，故本研究以上述皂苷类成分为载体展开网络药理学研究。利用毒性遗传学数据库（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http://ctdbase.org/）和人类基因数据库（GeneCards，https://www.genecards.org/）预测上述5 种皂苷成分的相关作用靶点，将靶点汇总得到三七总皂苷成分相关靶点。

1.2 异位骨化相关靶点和潜在治疗靶点的收集以“Heterotopic ossifification”为关键词在CTD 数据库、GeneCards 数据库、基因疾病关联数据库（DisGeNET）（https://www.disgenet.org/）和美国国家生物技术信息中心数据库（National Center for Biotechnology Information，NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索异位骨化发病相关的靶点，合并各数据库的靶点，去除重复靶点后与三七总皂苷成分相关靶点取交集，获得三七总皂苷干预异位骨化的潜在治疗靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）网络构建和关键靶点筛选将三七总皂苷干预异位骨化的潜在治疗靶点导入STRING 数据库（https://string-db.org/）中，设置条件：物种为“homo sapiens”，可信度为“medium confidence≥0.7”，进行蛋白相互作用关系分析。将蛋白相互作用关系文件导入Cytoscape 3.9.0 软件进行可视化分析得到PPI 网络，并利用网络拓扑学参数筛选出PPI 网络中的关键靶点。

1.4 基因本体（Gene Ontology，GO）分析和关键蛋白模块构建利用Cytoscape 3.9.0 软件的MCODE插件对PPI 网络进行模块化聚类分析，得到三七总皂苷治疗异位骨化的关键蛋白模块。利用Cluo GO 插件对关键蛋白模块进行GO-BP（Biological process）功能分析，选取P＜0.05 的BP 条目，得到关键蛋白模块主要涉及的生物过程。利用微生信在线平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）对GO 分析的结果进行可视化。

1.5 基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析利用Metascape 数据库（https://metascape.org/）对潜在治疗靶点进行KEGG富集分析，选取P＜0.01 的信号通路，得到三七总皂苷治疗异位骨化参与的途径。利用微生信在线平台对KEGG 富集分析结果进行可视化。为了分析信号通路与靶点成分之间相互作用关系，利用Cytoscape 3.9.0 软件构建活性成分-潜在治疗靶点-信号通路可视化网络。

1.6 分子对接从PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到活性成分的3D 结构，将其导入Chem3D 软件进行能量最小化，得到小分子的pdb文件；在PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）中搜索关键靶点的蛋白质结构，利用pymol 软件删除水分子和小分子配体，最后利用Auto vina 软件将处理得到的活性成分和关键靶点进行分子对接，以分析关键靶点与活性成分的作用关系。

2 结果

2.1 三七总皂苷主要活性成分与靶点预测三七总皂苷主要活性成分的结构见图1。通过CTD 数据库、GeneCards 数据库预测得到378 个与三七总皂苷5 个主要活性成分相关的靶点。其中得到三七皂苷R1 相关靶点91 个；人参皂苷Rg1 相关靶点134 个；人参皂苷Re 相关靶点296 个；人参皂苷Rb1 相关靶点259 个；人参皂苷Rd 相关靶点257 个。

图1 三七总皂苷主要活性成分的结构Figure 1 Chemical structure of the active components of Panax notoginseng saponins

2.2 异位骨化相关靶点及潜在治疗靶点的收集从CTD、GeneCards、DisGeNET 和NCBI 数据库共检索得到4 945 个异位骨化相关靶点，其中从CTD 数据库中得到4 733 个靶点；从GeneCards 数据库得到355 个靶点；从NCBI 数据库得到21 个靶点；从DisGeNET 数据库得到8 个靶点。将上述异位骨化相关靶点与三七总皂苷主要活性成分相关靶点取交集，共得到196 个潜在治疗靶点（图2）。

图2 异位骨化和三七总皂苷的共同靶点Figure 2 Common targets of heterotopic ossification and Panax notoginseng saponins

2.3 PPI 网络构建和关键靶点筛选将潜在治疗靶点导入STRING 数据库和Cytoscape 3.9.0 软件，隐藏游离节点得到三七总皂苷治疗异位骨化的PPI 网络（图3）。在PPI 网络中包含186 个节点（node）和1 700 条边（Edge），颜色越深代表度（Degree）值越大，说明该节点在网络中的地位越重要。选取网络拓扑学参数中度值、中介中心性（Betweenness Centrality， BC） 值、 接近中心性 （Closeness Centrality，CC）值大于中位数的靶点并筛选2 次，得到PPI 网络中26 个关键靶点（表1），这些关键靶点在网络中发挥着重要作用，主要包括丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、肿瘤坏死因子（TNF）、细胞肿瘤抗原p53（TP53）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、信号传导和转录激活因子3（STAT3）、转录因子Jun（JUN）和白细胞介素6（IL-6）等。

表1 三七总皂苷治疗异位骨化的关键靶点Table 1 Key targets of Panax notoginseng saponins in the treatment of heterotopic ossification

图3 三七总皂苷治疗异位骨化的蛋白互作PPI 网络Figure 3 Protein-protein interaction network of Panax notoginseng saponins in the treatment of heterotopic ossification

2.4 关键蛋白模块的构建及GO 分析利用MCODE插件对PPI 网络进行蛋白模块聚类分析，共得到9 个蛋白模块，其中评分最高的2 个蛋白模块网络是网络中的关键蛋白模块。对这2 个关键蛋白模块进行GO-BP 分析，发现模块1 的靶点蛋白主要涉及对化学刺激的反应、平滑肌细胞增殖的调控、内皮细胞增殖的正调控、炎症反应中细胞因子产生的正调控和血管相关平滑肌细胞增殖的调节等生物过程；模块2 的靶点蛋白主要涉及对机械刺激的反应、对β-淀粉样蛋白的反应、内皮细胞分化、成纤维细胞的调控和NIK/NF-kappaB 信号的正向调节等生物过程。这2 个关键蛋白模块的生物过程主要与炎症反应、细胞增殖、血管生长、应激反应等生理过程有关（图4）。

图4 MCODE 插件对PPI 网络蛋白模块聚类分析的结果Figure 4 Results of clustering analysis on PPI network protein modules by MCODE plugin

2.5 KEGG 分析通过Metascape 数据库对潜在治疗靶点进行KEGG 富集分析，得到20 组信号通路集群（图5）。这些信号通路集群包含162 条不同的信号通路，其中有多条信号通路与炎症反应、成骨细胞分化、血管内皮细胞增殖有关，包括PI3K/AKT 信号通路、TNF 信号通路、HIF-1 信号通路、FoxO 信号通路、IL-17 信号通路等（表2）。信号通路与靶点成分之间的相互作用关系见活性成分-潜在治疗靶点-信号通路可视化网络（图6）。

表2 三七总皂苷治疗异位骨化的KEGG 分析Table 2 KEGG analysis of Panax notoginseng saponins in the treatment of heterotopic ossification

图5 三七总皂苷治疗异位骨化潜在治疗靶点的20 组信号通路集群Figure 5 Twenty signal pathway clusters of potential therapeutic targets for the treatment of heterotopic ossification with Panax notoginseng saponins

图6 三七总皂苷治疗异位骨化的活性成分-潜在治疗靶点-信号通路可视化网络Figure 6 Visualization network of active components-potential therapeutic targets-signal pathways for Panax notoginseng saponins in the treatment of heterotopic ossification

2.6 分子对接本研究以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 为研究载体，以AKT1、TNF、TP53、CASP3、STAT3前5 个关键靶点为研究靶点进行分子对接。一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大。结合能小于0，表示配体与受体可以自发结合，结合能小于-5 kJ·mol-1，表示配体与受体紧密结合。结果表明，关键靶点与活性成分的结合能均小于-5 kJ·mol-1（图7），表明关键靶点与活性成分具有较强的结合活性。

图7 三七总皂苷治疗异位骨化活性成分与关键靶点的分子对接结果热图Figure 7 Heat map of molecular docking results of active components and key targets of Panax notoginseng saponins in the treatment of heterotopic ossification

3 讨论

异位骨化属于中医“瘀血痹”的范畴。中医认为，机体受到外伤后，筋脉、筋骨、皮肉、血络受损，血液溢于脉外，成为离经止血，故局部出现肿胀，瘀斑；瘀血凝滞，气血瘀阻，筋骨失养，经脉不通，不通则痛，故异位骨化形成过程中常常伴有疼痛；风寒湿邪痹阻筋骨，久之筋缩肉萎，关节活动不利，故后期多发生关节僵硬的症状[10]。对于异位骨化的治疗，中医多主张治“血”，应用活血化瘀、消肿止痛的治法，采用活血化瘀类中药内服、外治熏洗的策略，在临床上往往取得良好的疗效[11]。三七属止血药，首载于《本草纲目》，具有止血不留瘀，活血不耗气的特点。三七总皂苷是中药三七发挥活血化瘀活性的主要成分，有研究发现，三七总皂苷可以降低术后发生异位骨化的几率、具有防止软组织内异位骨形成的作用[8]。

影响药效发挥的一个重要的因素不仅与药物中包含的活性成分有关，也与活性成分在药物中的含量息息相关。因此本研究从药量的角度考虑三七总皂苷对异位骨化形成的影响。血栓通注射液中三七总皂苷的5 个活性成分的含量（三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd）占总量的85%以上，可直接入血在体内发挥作用。虽然目前并没有证据表明三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd直接影响异位骨化的形成和发展，但有大量研究表明这些成分可以影响炎症反应。故我们猜测这些成分主要通过干预局部炎症反应和氧化应激来预防异位骨化的发生。炎症反应是影响异位骨化发生的重要因素，创伤后机体炎症和低氧环境激活了Notch、TGF-β 和BMP 等信号通路，并促进了骨髓间充质干细胞增殖分化、血管发育和骨形成等过程，进一步诱导了创伤性异位骨化的发生和发展[12]。三七皂苷R1 参与了氧化应激和抗炎反应的调节，当发生脊髓损伤时，三七皂苷R1 可以激活Nrf2/HO-1 信号通路来减轻氧化应激、神经元凋亡、炎症反应，从而达到减轻组织损伤和运动神经元损伤的目的，对于预防神经源性异位骨化的发生具有重要意义[13]。人参皂苷Rg1 也具有抗炎的药理作用，Zhang 等[14]发现，人参皂苷Rg1 减轻了损伤组织的水肿与出血，减少炎症细胞浸润和细胞坏死，修复了损伤组织；而且，人参皂苷Rg1 也显著抑制了肿瘤坏死因子、白细胞介素1β、白细胞介素6 等炎症因子的活性，减轻了创伤后的炎症反应。人参皂苷Rb1 具有抗炎、抗氧化等药理作用，人参皂苷Rb1 可以直接清除活性氧，保护组织免受氧化应激损伤[15]。我们猜测，当发生肢体创伤后，人参皂苷Rb1 可以干预局部的低氧环境，从而干预软组织内异位骨化的形成。人参皂苷Rd、人参皂苷Re 也参与调节了炎症反应，但它们在异位骨化上的作用还需进一步研究。

通过对三七总皂苷治疗异位骨化的PPI 网络和蛋白模块分析，我们筛选出26 个关键靶点，包括AKT1、TNF、TP53、CASP3、STAT3、JUN、IL-6等。这些关键靶点聚类分布于评分前两位的关键蛋白模块上，主要与炎症反应、细胞增殖等生理过程有关。AKT1 是与骨形成和发育密切相关的一种蛋白，既可以促进成骨前体细胞分化，也可以调节破骨细胞生成。在一项体内研究[16]中，将小鼠的AKT1基因敲除后，可以观察到实验组小鼠的破骨细胞活性明显降低；破骨前体细胞生成减少；严重影响了骨组织的形成。另外，AKT1 与巨噬细胞极化有关，AKT1 的激活可以促进巨噬细胞向M2 型极化，并分泌IL-10、TGF-β、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）、Fizz1、YM1 等抗炎因子，促进炎症消退、伤口愈合和组织修复[17]。我们猜测AKT1 通过类似的机制减轻了局部软组织内异位骨化形成过程中的炎症反应。在异位骨化的发病过程中，肿瘤坏死因子扮演着重要的角色。罗涛[18]对肱骨骨折术后各组TNF-α、BMP-2 和BMP-9 三种细胞因子在组织标本的表达情况的观察中发现，在术后没有发生异位骨化的患者一组中，TNF-α 显著表达，而骨生长因子BMP-2 和BMP-9 的表达则显著下降，证明在异位骨化中，TNF-α 与BMP 呈负相关关系。 Mukai T 等[19]发现TNF-α 降低了骨钙素、RUNX2 等成骨标志物表达和碱性磷酸酶活性，在骨分化微环境中抑制了BMP 诱导的成骨分化。这说明了TNF-α 作为保护因子，对于异位骨化的预防和治疗具有重要意义。STAT3 与神经源性异位骨化的发生具有密切关系，研究者发现，脊髓损伤后那些发生异位骨化的小鼠的肌肉内STAT3 的磷酸化显著增加，然而通过抑制STAT3 的磷酸化，可以增加小鼠肌肉内肌卫星细胞的增殖，减少了肌肉组织中异位骨的体积，降低了异位骨化发生的概率[20]。IL-6 是一种与创伤性异位骨化发展相关的炎症因子，一项前瞻性研究[21]发现，受到创伤后，发生异位骨化的患者血清中的IL-6 水平持续升高，并且IL-6 水平的升高与发生异位骨化的严重程度成正相关；另外，有研究[22]表明，IL-6 对异位骨化的形成具有促进作用，IL-6 可激活BMP2、RUNX2、成骨细胞特异性转录因子（OSX）、骨钙蛋白（OCN）等成骨细胞因子，从而参与胸椎异位骨化的形成。目前，并没有研究[23]表明TP53、CASP3 和JUN 与异位骨化发生有关系，但有研究报道，这些靶点与骨形成和组织纤维化有关，可以参与异位骨化中纤维组织的形成。

通过GO 生物过程分析和KEGG 富集分析发现，三七总皂苷主要通过PI3K/AKT、HIF-1、FoxO和IL-17 信号通路参与炎症反应、细胞增殖、成骨分化有关的生物过程来干预异位骨化的形成。PI3K/AKT 信号通路作为一条与细胞生长、增殖、炎症反应相关的信号通路，参与调控了异位骨化的成骨分化过程。在动物实验中，使用PI3K 抑制剂阻断了PI3K/AKT 信号通路后，小鼠肌肉内的软骨基质和骨量明显减少， BMP2 诱导的异位骨化的成骨分化明显受到抑制[24]；在一项体内研究[25]中发现，大鼠肌腱源性干细胞（一种存在于肌腱生态位的前体细胞，创伤后的不正确分化导致肌腱钙化）的成骨分化能力与PI3K/AKT 信号通路呈负相关；这些研究都表明PI3K/AKT 信号通路与异位骨的形成和发展密切相关。HIF-1 信号通路与异位骨化的缺氧环境的调节有关，由于缺氧环境是获得性异位骨化发生必不可少的条件，当组织受到创伤后，局部会形成缺氧微环境，缺氧诱导因子1（HIF-1）受到低氧刺激后被激活，从而调节相关细胞因子的表达，促进成骨前体细胞和间充质细胞分化，在软组织内形成异位骨[26]。有研究[27]表明，HIF-1α 在肌腱切断术后发生异位骨化的小鼠中高度表达，应用HIF-1 抑制剂阻断HIF-1信号通路后，上述小鼠软组织内异常骨组织的形成显著减少，我们推测三七总皂苷通过HIF-1 信号通路干预创伤后组织缺氧环境下的成骨分化来干预异位骨化的形成。TNF 信号通路可通过调节炎症反应和细胞增殖来干预异位骨化的发生，有研究[28]发现长时间的TNF 治疗可促进体外脂肪来源干细胞分泌促炎因子IL-8，增加骨祖细胞的数量，导致软组织内形成异位骨；而且，研究[29]发现脂肪来源的间充质干细胞经过TNF 干预后展现出更强大的成骨分化效能；这说明了TNF 信号通路对于异位骨化发生的重要意义。FOX 信号通路参与了细胞凋亡、细胞周期控制、葡萄糖代谢和抗氧化应激的调节，并且与发生异位骨化过程中的炎症反应相关；有研究发现FOX 转染后的小鼠骨骼肌中的趋化因子和免疫细胞显著上调，这种改变对控制骨骼肌内炎症反应具有重要意义[30]。IL-17 信号通路通过调节炎症微环境的成骨分化来调控创伤性异位骨化的形成，在这条通路上，IL-17 上游蛋白通过激活IL-17R/β-catenin 信号途径（成骨细胞分化最重要的合成代谢信号通路之一）诱导间充质干细胞的成骨分化，并在体内促进创伤性异位骨化的发生；相反，通过抑制IL-17 信号通路可抑制异位骨的形成，从而防止发生异位骨化[31]。

我们通过网络药理学和分子对接的方法对三七总皂苷治疗异位骨化的分子机制进行了综合分析，证明了三七总皂苷治疗异位骨化是多成分、多靶点、多条通路共同作用的结果，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1 和人参皂苷Rd 是三七总皂苷治疗异位骨化的有效成分，它们通过AKT1、TNF、TP53、CASP3、STAT3、JUN 和IL-6等靶点调控PI3K/Akt 信号通路、TNF 信号通路、HIF-1 信号通路、FoxO 信号通路、IL-17 信号通路等信号通路参与调控了炎症反应、骨细胞增殖和成骨细胞分化等生理过程来干预异位骨化的发展。以上的靶点和信号通路不仅为异位骨化的临床治疗提供了药理学依据，也为治疗异位骨化新药的开发提供了基础。